• 在与H0相垂直的方向上再施加一个比H0弱很多的附加磁场H1（称为 射频场），当H1的频率与原子核的进动频率相同时，原子核从附加 磁场（射频场）吸收能量，产生自旋能级的跃迁。这就是核磁共振 （见图）。
核磁共振条件的理论推导
• 在外加静磁场H0的作用下，核自旋量子数不为零的原子核会发生能 级分裂。 以1H为例，其I=1/2，在静磁场H0中，它的进动可以有2I+1=2个 方向，即有2个能级，分别为顺磁场和逆磁场两种取向。如图所示。
• 由NOE导出的NOE距离约束 下限取1.8Å， 上限：强NOE，2.5-2.7Å, 中等NOE, 3.0-3.5Å，弱NOE, 5.0Å， 很弱NOE, 6.0Å
• 由氢键提供的距离约束 1HN与羰基氧的距离：2.3Å--1.8Å 亚氨基15N与羰基氧的距离：3.4Å--2.4Å
二面角约束文件
J耦合常数可由Karplus方程直接推算出相应的主链和侧链的二面 角f和c’:
NOE信号可以导出质子间距离，这是计算蛋白质溶液三维结构的 最主要实验依据。
3.5 蛋白质溶液三维结构的计算
由核磁共振ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ据计算蛋白质溶液三维结构的流程图
3.5.1 建立核磁共振波谱数据的约束文件
距离约束文件：
NMR技术依赖于一个外加磁场和某些原子核中的天然“小磁铁”之间的 相互作用。
用NMR技术解析一个蛋白质的结构就象一件出色的侦探工作。
NMR使用的磁场
大多数强度范围在500mHz(11.7tesla)-800mHz(18.8tesla)之间。 NMR磁体是超导磁体 Vrian公司的NMR波谱仪（见图）
主链f角和侧链c’角的约束
3.5.2 获得蛋白质三维结构的不同构象集合
计算NMR三维结构的软件：DGII, Xplor, DIANA等。
具体计算蛋白质三维结构时，必须要获得一个蛋白质构象的集合， 包括40-50个蛋白质三维结构。
为什么要获得构象集合？
3.5.3 蛋白质NMR结构的精确性和正确性
X射线晶体学和NMR波谱学测定的最大结构的比较
NMR相对于晶体学的优点：
NMR使用溶液样品，因此，它不局限于那些能很好结晶的样品。 NMR可以测定不同溶液条件下的分子结构。 NMR也使得研究分子的性质相当容易，例如，研究分子的柔性、分子与
其它分子的反应或相互作用、分子的动态特征等。
NMR技术的原理简述
3.7 蛋白质折叠的NMR研究
蛋白质折叠是很迅速的过程 研究蛋白质折叠的意义 研究蛋白质折叠的方法 肌红蛋白的折叠研究：
The Sweetest Puzzle
"Getting a protein structure using NMR is a lot of fun," says Chele DeRider, a graduate student at the University of Wisconsin-Madison. "You're given all these pieces to a puzzle and you have to use a set of rules, common sense, and intuitive thinking to put the pieces together. And when you do, you have a protein structure." DeRider is working at UW-Madison's national NMR facility. She is refining the structure of brazzein, a small, sweet protein. Most sweet-tasting molecules are sugars, not proteins; so brazzein is quite unusual. It also has other remarkable properties that make it attractive as a sugar substitute. It is 2,000 times sweeter than table sugar —with many fewer calories. And, unlike aspartame (NutraSweet?), it stays sweet even after 2 hours at nearly boiling temperatures.
原子核的自旋与进动
• 原子核都具有电荷和质量，自旋量子数I≠0的原子核由于能够自旋 因而还具有自旋动量或角动量。旋转的电荷有磁场，有自旋的核就 有与角动量有关的磁矩。
• 在一个强大而均匀的外加磁场H0中，自旋核的磁矩将沿外磁场的方 向进行取向。自旋核将产生进动。（见图）
核磁共振的产生
• 原子核自旋轴在外加磁场H0中的取向是量子化的，每一个取向相当 于一个自旋能级。 H0的增加不能产生自旋能级的跃迁。
可通过改变辐射电磁波的频率（扫频）或改变外加磁场的强度 （扫场）的办法来达到共振的目的。扫频在技术上有困难。 NMR谱仪都是保持射频振荡器的频率恒定，而连续改变H0的办 法达到共振的目的。见图。
3.2.4 化学位移
由电子云的屏蔽作用所引起的共振时磁场强度的移动，称为化学 位移。见图
化学位移与原子的核外电子云密度有关，后者又与原子核的化学 环境有关。因此，可根据化学位移的大小，来考察原子核所处的 化学环境，从而对化合物进行结构分析。
3.2.5 谱线强度
在常规一维谱中，谱线强度与参与共振的粒子数成正比。（见图）
3.2.6 自旋耦合与自旋裂分
自旋核的核磁矩通过成键电子影响邻近核，引起其共振谱线增多， 这种现象称为自旋裂分，自旋核之间的相互作用称为自旋耦合。 见图。
裂分的共振谱线的能量差，称为自旋耦合常数，以J表示。J与分 子结构有关。
强度为900mHz的Vrian公司的NMR波谱仪
3.2 NMR的基本原理
3.2.1 原子核的自旋与核磁共振
原子核的自旋量子数I
• I与原子核的质量数和原子序数有关
核自旋量子数I与质量数和原子序数的关系
质量数 原子序数
自旋量子数 I
奇数 偶数或奇数
半整数
偶数
偶数
0
偶数
奇数
1,2,3,…(非零整数)
• I=0的原子核，如12C, 16O, 32S等，没有自旋，不产生核磁共振现 象。
• I≠0的原子核，具有自旋，可产生核磁共振现象。
• 结构生物学中，经常研究的原子核有：1H, 13C, 15N, 31P, 它们的自 旋量子数I=1/2。其中，1H核在生物分子中广泛存在，13C, 15N是 稀有同位素。
为了确定化学位移的大小，选一个参比核，规定其化学位移为零。 对于1H谱常以四甲基硅烷（TMS）为参比。参比核的屏蔽作用 很强，在最高场有一个强的尖峰，定义其化学位移为0，在其低 场区（左方）的化学位移为正值。化学位移的大小用下式计算：
d = (H参-H样)/H参 x 106 = (n样-n参)/n参 x 106 d的单位为ppm, 即10-6，大多数质子的d 在1-12之间。
多维谱包含了比一维谱丰富得多的信息。
实验方法灵活多样，可以设计出多种实验脉冲程序，从而产生各种有用 的多维NMR技术。
可以利用多维谱，间接地检测到在普通NMR谱中得不到的跃迁，如多量 子跃迁。
3.4 多维NMR确定蛋白质溶液三维结构的基本原理
3.4.1 蛋白质的结构信息
不同二级结构提供了具有不同结构特征的原子间距离及肽键二面角。 a螺旋中，相邻两个残基的酰胺质子(1HN)在空间距离上很接近；而前
第三章 核磁共振波谱学
Nuclear magnetic resonance spectroscopy, (NMR)
3.1 简介
除X射线衍射以外，NMR技术是目前最普遍用于测定生物大分子空 间结构的技术。
NMR波谱学测定结构的方法比X射线晶体学方法年轻了20年。
1982年，确立了同核二维NMR谱测定蛋白质溶液构象的标准方法。 这一方法目前仍是一个发展的领域。
3.2.2 弛豫
弛豫是高能态的自旋核释放能量返回低能态的过程。通过弛豫过 程可以获得稳定的核磁共振信号。
弛豫过程有两种：
• 自旋晶格弛豫，也称纵向弛豫。以弛豫时间T1表示。 • 自旋-自旋弛豫，也称横向弛豫。用弛豫时间T2描述。
3.2.3 吸收的测量
所有NMR波谱仪都采用测定与吸收有关的正信号。
自旋耦合与自旋裂分可提供相互作用的核的数目、类型及相对位 置等结构方面的信息。
3.3 多维NMR
一维NMR谱是一个频率变量的函数：S(w) ，见图
二维NMR谱是两个频率变量的函数：S(w1,w2), 见图
二维NMR谱的原理 二维NMR谱中的对角线峰和交叉峰 不同类型的二维NMR波谱：二维分解谱、二维相关谱（COSY)、二维
而空间位置比较靠近的几个环可能成为比较柔性的活性部位。 这些具有不同结构特征的原子核间距、肽健二面角、肽链的动态特性等
都是多维NMR所要提取的蛋白质的结构信息。
3.4.2 核磁共振的波谱信息
直接用于测定蛋白质溶液三维结构的主要波谱参数为：
（1）化学位移：反映了空间结构及局域微环境的结构情况。 （2）J耦合常数：酰胺质子与a质子之间的耦合常数3JNa与主链
自旋回波相关谱（SECSY）、二维NOE谱（NOESY）。 NOESY谱---核欧沃豪斯效应波谱---反应的结构信息
三维NMR是三个频率变量的函数：S(w1,w2,w3), 四维NMR是四个频 率变量的函数：S(w1,w2,w3,w4)。见图。
多维NMR谱的特点：
多维谱可以把一维谱中的重叠峰在二维或三维方向展开，便于NMR谱的 解析。
的二面角f有关，a质子与b质子之间的耦合常数3Jab与侧链二面角 c’有关。 （3）NOE（核欧沃豪斯效应）：NOE信号强度提供了蛋白质中 氢原子对之间的距离信息。