第1节基因工程概述【学习目标】1、说出基因工程的概念（A）2、简述基因工程的诞生历程（A）3、说出DNA重组技术所需的三种基因工具的作用（A）4、简述基因工程基本操作程序的四个步骤（B）【基础梳理】一、基因工程的概念是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞并使重组基因在受体细胞中表达，产生人类所需的基因产物的技术。
（1）操作环境：生物体外（2）操作对象：基因（3）操作水平：DNA分子水平（4）基本过程：剪切→拼接→导入→表达（5）结果：人类需要的基因产物二、基因工程的工具及作用（一）限制性核酸内切酶（简称限制酶）“分子手术刀”1、来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
2、作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3、特点:具有专一性，表现在两个方面：①识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列。
②切割特定序列中的特定位点。
4、结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
例1、下列有关基因工程中限制内切酶的描述，错误的是（）A．一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B．限制性内切酶的活性受温度的影响C．限制性内切酶能别和切割RNAD．限制性内切酶可从原核生物中提取（二）DNA连接酶“分子针线”1、分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类2、作用：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【疑难解析】1、两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：（1）相同点：都缝合磷酸二酯键（2）区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶来源于T4噬菌体能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。
2、DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比较(三) 载体“分子运输车”1、载体的作用：载体是基因运输工具，在基因操作过程中，使用载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
2、载体必须具备三个条件：（1）能在受体细胞中复制并稳定保存。
（2）具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入。
（3）具有某些标记基因，以便进行筛选。
3、载体的种类：质粒、噬菌体和动、植物病毒等。
最早应用最常应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。
三、基因工程的基本过程(一) 获得目的基因（目的基因的获取）1、获取方法主要有两种：（1）从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。
（2）用人工的方法合成。
★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。
★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。
2、利用PCR技术扩增目的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）过程：第一步：加热至90～95℃ DNA解链为单链；第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。
（5）特点：指数形式扩增(二) 制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）1、重组DNA分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因。
★标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
2、方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。
(三) 转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）1、转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2、常用的转化方法：（1）将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术（农杆菌转化法），其次还基因枪介导转化技术（基因枪法）和花粉管通道技术（花粉管通道法）。
（2）将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。
此方法的受体细胞多是受精卵。
（3）将目的基因导入微生物细胞：Ca2＋处理法。
例2、以重组DNA技术为核心的基因工程正在改变着人类的生活。
请回答下列问题。
（1）获得目的基因的方法通常包括和。
（2）切割和连接DNA分子所使用的酶分别是和。
（3）运送目的基因进入受体细胞的载体一般选用病毒或，后者的形状成。
（4）由于重组DNA分子成功导入受体细胞的频率，所以在转化后通常需要进行操作。
（5）将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和序列上是相同的。
(四) 筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与鉴定）1、分子水平的检测（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用RNA分子杂交技术。
（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。
提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的2、个体生物学水平的鉴定有时还需进行个体生物学水平的鉴定，如抗虫或抗病的鉴定等。
四、基因工程的意义：能够打破生物种属的界限（即克服远源杂交不亲和的障碍），在分子水平上定向改变生物的遗传特性。
【基础检测】1. 下列关于基因工程的叙述中错误的是（）A. 基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿定向改造生物，培育新品种B. 基因工程技术是唯一能冲破远源杂交不亲和障碍，培育生物新类型的方法C. 基因工程的基本工具是：限制性核酸内切酶、DNA连接酶和基因的运载体D. 基因工程的研究成果，目前大多需要通过发酵工程和酶工程来实现产业化2．基因工程技术也称为DNA重组技术，其实施必须具备四个必要的条件是（）A. 目的基因、限制性内切酶、运载体、体细胞B. 重组DNA、RNA聚合酶、内切酶、连接酶C. 模板DNA、信使RNA、质粒、受体细胞D. 工具酶、目的基因、运载体、受体细胞3. 两个核酸片段在适宜条件下，经X酶的作用，发生了如下变化，则X酶是（）A．DNA连接酶B．EcoR I酶C．DNA聚合酶D．限制酶4. 下图为四种限制酶BamHI、EcoRI、ttindIII和B硝辨的识别序列。
它们切割出来的DNA黏性末端可以互补配对的是（）A．BamH I和BglⅡ B．BamHI和HindⅢC．BamHⅠ和EcoR I D．EcoR I和Hind Ⅲ5. 限制性内切酶的作用实际上就是把DNA上某些化学键打断，一种能对GAATTC专一识别的限制酶，打断的化学键是（）A. G与A之间的键 B．G与C之间的键C．T与A之间的键 D. 磷酸与脱氧核糖之间的键6．将单个脱氧核昔酸连接到脱氧核昔酸链上的酶是（）A. DNA连接酶B. DNA酶C. DNA解旋酶D. DNA聚合酶7. 用于判断目的基因是否转移成功的方法中，不属于分子检测的是（）A. 通过害虫吃棉叶看其是否死亡B. 目的基因片断与DNA探针能否形成杂交带C．目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带D. 目的基因表达产物蛋白质能否与抗体形成杂交带8.（多选）基因工程的运载体必须具备的条件是（）A．能在受体细胞内复制并保存B．具有多个限制酶切点C．有特殊的遗传标记基因D．环状的DNA分子9．（多选）下列哪些可作为基因工程技术中常用的基因运载工具（）A．大肠杆菌 B．质粒 C．动物病毒 D．线粒体10．为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。
我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处，DNA连接酶作用于处。
（填“a”或“b”）（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法。
（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用技术。
该技术的核心是和。
（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的作探针进行分子杂交检测，又要用方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。
【能力提升】1．下列关于基因工程的说法正确的是（）①基因工程的设计和施工都是在分子水平上进行的②目前基因工程中所有的目的基因都是从供体细胞直接分离得到的③基因工程能使科学家打破物种界限，定向地改造生物性状④只要检测出受体细胞中含有目的基因，那么目的基因一定能成功地进行表达A.①②B.①③C.②④D.③④2．在基因工程中，科学家所用的“剪刀”、“针线”和“载体”分别是指( )A.大肠杆菌病毒、质粒、DNA连接酶B.噬菌体、质粒、DNA连接酶C.DNA限制酶、RNA连接酶、质粒D.DNA限制酶、DNA连接酶、质粒3. 镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。
检测这种碱基序列改变必须使用的酶是（）A. 解旋酶B. DNA连接酶C. 限制性内切酶 D、RNA聚合酶4．已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指。
如果在该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。
现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（）A．3 B．4 C．9 D．125．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是（）A．Ti质粒上 B．受体细胞染色体DNA上 C．T-DNA D．农杆菌的拟核6．下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。
已知细菌B细胞内含质粒A，也不含质粒A上的基因。
判断下列说法正确的是（）A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法或基因枪法B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A 的细菌D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长7．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。
下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是（）A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白8. 基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。