钙离子载体对牛精子体外受精及胚胎发育的影响彭礼繁１，罗光彬・，（１．沈阳农业大学动物胚胎工程实验室，辽宁沈阳李东全－，陈自洪ｚ，石德顺ｚ１１０１６ｌ；２．广西大学动物繁殖研究所，广西南宁５３０００５）摘要：在牛精子获能液中添加不同浓度的钙离子载体，应用体外培养技术对牛精子体外获能及早期胚胎发育作了研究。
通过对顶体反应、超激活、活率和早期胚胎发育率的观察，筛选出获能液中最适的钙离子载体浓度，作用时间及其有利于早期胚胎发育的最佳浓度。
结果表明：钙离子载体在诱导牛精子获能上存在一个浓度一时间阅值，其最佳浓度和时间组合是Ｏ．１ｕＭ处理２ｍｉｎ或者０．１５ｕＭ处理Ｏ。
５ｍｉｎ，此时的囊胚率最高；钙离子载体的添加不能诱导牛精子获能的发生．关键词：钙离子载体；牛；精子；体外受精；胚胎发育中图分类号：Ｓ８１４．４文献标识码：Ａ文章编号：１００５—８５６７（２００８）０４一００３５一０４目前，学术界对Ｃａｚ＋在精子获能中的作用存在争议。
有人认为获能过程中精子细胞内ｃａ２＋浓度不变，但多数学者认为精子细胞内的ｃａｚ‘嶂衣度增加。
Ｂａｌｄｉ等【－１证实人精子在获能前２ｈ，细胞内Ｃａ２＋浓度从７０ＩｌＭ增至２５０ｐＭ。
Ｃｒｏｓｓ认为Ｃａ２＋在精子获能中的作用是通过刺激腺苷酸环化酶（ＡＣ）的合成来增加环腺苷酸（ｃＡＭＰ）的合成幽，而ｗａｓｃｏ则认为Ｃａｚ＋能通过ｃＡ＾ＩＰ酶来降解ｃＡＭＰ合成［３］。
此外Ｂａｋｅｒ等认为细胞内Ｃａ２＋的增加会抑制细胞内ＡＴＰ的利用，从而妨碍ＰＴＰ团。
Ｃａｚ＋在精子获能中的分歧，原因可能在于对顶体反应中Ｃａ２＋作用的认识不同，以及研究Ｃａ２＋作用和相关事件的复杂性。
自从Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ等发现Ｃａｚ＋对精子顶体反应起重要作用，同时证明ＩＡ（ＩｎｖｉｔｒｏＡｒｔｉｆｉｃｉｔｉｏｎ）能诱导精子获能促使顶体反应的发生后，Ｃａｚ＋载体在获能中的作用引起了关注网。
目前，Ｃａ斗载体在牛（Ｆｕｋｕｄａ等，１９９０；Ｊａｎｕｓｋａｕｓｋａｓ等，２０００）、羊（张嘉保等，１９９０）、猪（Ａｔｓｕｓｈｉ等，２００４）和水牛（Ａｂｄｕｌ等，２００５）的精子体外获能中，均获得成功。
但是由于钙离子载体．Ａ２３１８７作用剧烈，处理时间过长或浓度过高，会导致精子死亡。
目前，在牛精子获能中钙离子载体的添加量还不是很清楚，为此我们进行了钙离子载体对牛精子体外受精及其早期胚胎发育的影响试验，筛选出获能液中最适的钙离子载体浓度及其有利于牛早期胚胎发育的最佳浓度，从而为牛胚胎体外生产商品化奠定基础。
１材料与方法１．１材料１．１．１主要仪器荧光显微镜、生物显微镜附显收稿日期：２００８一０４—２４相系统、Ｃ０。
培养箱、倒置显微镜及显微操作系统等来自于沈阳农业大学动物胚胎工程实验室。
１．１．２主要试剂ＴＣＭ一１９９、Ｄ—ＰＢＳ、钙离子载体－Ａ２３１８７、Ｂ０（体外获能液）等均购于ｓｉｇｌｎａ公司。
１．１．３试验材料采集与保存牛卵巢采自沈阳市于洪区金氏牛羊屠宰场，在牛宰后３０ｍｉｎ内采集卵巢，保存在３５℃左右的装有灭菌生理盐水的保温瓶中，生理盐水中添加Ｏ．２ｍｇ／ｍＬ青霉素和０．２ｍｇ／ｍＬ链霉素，２ｈ内带回实验室。
牛冷冻精液购自辽宁省肉牛繁育中心，０．２５ＩｎＬ／管。
１．２方法１－２．１卵泡卵母细胞的采集和成熟培养按文献［１蛐３介绍的方法进行。
１．２．２成熟卵母细胞的体外受精（肝素受精法）成熟培养后，把卵母细胞先用洗涤液洗３次，再用处理好的精液洗涤１次，移入覆盖于石蜡油下的微滴中进行获能（受精）处理。
精液处理方法：细管冻精于３９℃温水中解冻后，检查其活率。
活率合格后，置于灭菌离心管中，加入精子洗涤液，混匀后ｌ５００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃上清液（两次）。
然后加入获能（受精）液，再ｌ０００ｒ／ｍ离心ｌｍｉｎ，弃去沉淀。
最后再加入获能液，１５００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃上清液，用获能液调整精子浓度到１×１０６个／ｍＬ。
１．２．３成熟卵母细胞的体外受精（钙离子载体受精法）细管冻精于３９℃温水解冻后，检查其活率，活率合格后，置于灭菌离心管中，加入精子洗涤液，混匀后１５００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃去上清液（两次）。
最后再加入获能液，准确计时，计时结束后，马上加入等体积的钙离子载体阻断剂，并充分万方数据・３６－试验研究钙离子载体对牛精子体外受精及胚胎发育的影响一彭礼繁，等混合。
ｌ５００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃去上清液，用１：１的获能液和钙离子载体阻断剂的混合液调整精子浓度至１×１０６个／ＩＩｌＬ。
１．２．４受精卵的体外培养［・州］卵母细胞与精子共培养１６～１８ｈ，完成获能（受精）后，受精卵在胚胎培养液中洗涤，吹打法除去附着在卵母细胞上的精子和颗粒细胞。
吹打完毕后移入培养液中，采用与颗粒细胞共培养的方法进行微滴培养（１０～１５个／滴）。
每４８ｈ采用半量法置换培养液，观察并记录胚胎发育情况。
１．２．５牛精子获能的判断标准及方法精子获能将发生一系列变化。
主要表现为代谢活动增强，出现头部侧向曲线运动加强，鞭打幅度加宽的超活化现象；另外，获能后的精子头部膨大，易发生顶体反应；项体反应成功的诱导被认为是获能完成的终点，即进行顶体反应的精子已经获能。
因为顶体反应比受精更接近获能过程，且顶体反应分析过程较简单，本试验采用该方法来判断精子是否获能。
１－２．６超激活率的观察精子获能后，在３７℃下，４００倍的相差显微镜下观察精子的运动形式。
精子呈现激烈曲线运动（鞭打样）的即为超激活精子。
１．２．７项体反应的观察精子获能后，１５００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃去上清液，在沉淀中加入含有１５ｕｇ／ｍＬ溶血磷脂酰胆碱（Ｌｙｓｏ—ＰＣ）获能液。
孵育完成后，常规抹片，将风干后的抹片置于在３７℃水浴中预热的考马斯亮蓝染色液中浸染５～７ｍｉｎ，然后在ｌ０００倍显微镜下检查。
顶体区不着色或着色非常浅者为获能精子，顶体区呈蓝紫色者为非获能精子。
１．２．８活率的观察在４００倍生物显微镜下观察精子的运动形式，呈直线运动的则为活精子。
１－２．９胚胎发育的观察受精完成后，进行胚胎的早期培养，每４８ｈ半量更换培养液，同时在实体显微镜下观察胚胎发育情况，记录卵裂数、桑椹胚数和囊胚数。
１．３试验设计１．３．１钙离子载体浓度和作用时间对牛精子体外获能的影响该试验采用３×３二因子试验设计，浓度设０．０５ｕＭ、０．１ｕＭ和Ｏ．１５ｕＭ，牛精子体外获能处理时间设０．５ｍｉｎ、１ｍｉｎ和２ｍｉｎ，正常受精卵培养采用同一培养条件作对照组。
１．３．２钙离子载体诱导钙离子内流对牛精子获能的影响试验设三个处理，即Ａ：Ｏ．１ｕＭ钙离子载体＋２．２４ｆＩｌＭＣａＣｌ舢２Ｈ２０，Ｂ：０．１ｕＭ钙离子载体，ｃ：２．２４ｌｌｌＭＣａｃｌ。
．２Ｈ２０。
正常受精卵培养采用同一培养条件作对照组。
１．４统计分析本试验中的数据以平均数±标准误表示，用ＳＰＳＳｌｌ．０统计软件进行方差分析。
２结果与分析２．１钙离子载体浓度和作用时间对牛精子顶体反应、活率和超激活的影响从表１可以看出，钙离子载体浓度对精子顶体反应、活率和超激活均有极显著影响（Ｐ＜０．０１）。
浓度超过Ｏ．１ｕＭ的项体反应率显著高于Ｏ．０５ｐＭ时（Ｐ＜０．０１）；从活率方面来看，高浓度时活率显著下降，下降幅度与低浓度时相比，高达３０．５％；超激活率则是高浓度和低浓度时均较低，但０．１ｕＭ和０．１５ｌｌＭ之间差异不显著（Ｐ＞０．０５），二者与０．０５ｕＭ之间的差异极显著（Ｐ＜０．０１）。
从作用时间方面看，钙离子载体作用时间对顶体反应率的影响差异不显著（Ｐ＞０．０５），对活率的影响差异极显著（Ｐ＜Ｏ．０１），作用ｏ．５ｍｉｎ的活率显著高于作用２ｍｉｎ的活率（４２．２％ＶＳ３０．８９６），而与ｌｍｉｎ之间的差异不显著（Ｐ＜０．０５），ｌｍｉｎ与２ｍｉｎ之间的差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５）；对超激活率的影响差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５），超激活率以作用ｌｍｉｎ时为最高。
从整个实验来看时间与浓度互作对项体反应和活率的影响，差异不显著（Ｐ＞０．０５），而对超激活率的影响极显著（Ｐ＜０．０１）。
２．２钙离子载体浓度和作用时间对早期胚胎发育的影响由表２可见，钙离子载体作用时间对卵裂率和桑椹胚率有显著影响（Ｐ＜０．０１）。
随作用时间的延长，早期胚胎发育率先增后减，当作用时间超过ｌｍｉｎ，胚胎发育率开始下降；作用时间对囊胚发育率无显著影响（Ｐ＞Ｏ．０５）。
从浓度方面看，浓度对早期胚胎发育有极显著的影响（Ｐ＜Ｏ．０１）。
低浓度（Ｏ．０５“Ｍ）时无论作用时间长短，早期胚胎发育率均不高；高浓度（０．１５ｐＭ）时随作用时间延长，早期胚胎发育率显著下降。
在整个试验期间，时间和浓度互作对早期胚胎发育有极显著影响（Ｐ＜０．０１）。
２．３钙离子载体、钙离子对牛精子顶体反应、活率和超激活的影响由表３可以看出，顶体反应率和超激活率Ａ组均显著高于其它两组（Ｐ＜０．０１），其它两组间差异不显著（Ｐ＞０．０５）；而活率方面恰好相反，即Ａ组的活率显著低于其它两组（Ｐ＜０．０１），其它两组间差异不显著（Ｐ＞Ｏ．０５）。
２．４钙离子载体、钙离子对早期胚胎发育的影晌万方数据钙离子载体对牛精子体外受精及胚胎发育的影响一彭礼繁，等试验研究・３７・表１钙离子载体对牛精子顶体反应、活率和超激活的影响注：１．带有不同的小写字母表示差异显著（Ｐ＜ｏ．０５），带有不同的大写字母表示差异极显著（Ｐ＜ｏ．０１）。
下同。
表２钙离子载体对牛早期胚胎发育的影响由表４中可以看出，早期胚胎发育率，Ａ组显著高于其它两组（Ｐ＜０．０１）。
Ａ组的卵裂率和桑椹胚率是其它两组的５倍多，囊胚率则是其它两组的３倍左右，其它两组间差异不显著（Ｐ＞０．０５）。
裹３钙离子载体、钙离子对牛精子顶体反应、活率和超激活的影响表４钙离子载体、钙离子对早期胚胎发育的影响３讨论本试验结果表明，Ｂ．０．液中钙离子载体浓度、作用时间对精子获能和早期胚胎发育有显著影响。
当浓度为０．１ｕＭ，作用时间为ｌｍｉｎ和２ｍｉｎ时，顶体反应率、超激活率和早期胚胎发育率均较高，这与Ｆｕｋｕｄａ和Ｌａｎｄｉｍ的结果相一致［６］：但与Ｔａｔｅｎｏ等的结果差异较大啪。
Ｔａｔｅｎｏ等在制备牛精子染色体时，以ｎｌＢｗｗ培养基及１０ｕＭ的钙离子载体处理精子１０ｍｉｎ诱导获能，低浓度钙离子载体（低于４｜ｌＭ时）处理精子不能诱导精子获能。
浓度方面的这种巨大差别，可能与获能液中的其它活性添加物有关，例如，钙离子载体诱导精子获能与咖啡因有协同作用。
Ａｏｙａｇｉ等研究表明［５］：钙离子载体一Ａ２３１８７结合咖啡因对牛的精子进行获能处理，能迸一步提高受精分裂率和囊胚发育率；在钙离子载体诱导精子获能过程中，添加亚牛磺酸有助于牛精子获能。
具体原因还有待进一步研究。