５９８食品与生物技术学报第２９卷的产物，经ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ双酶切得到长约２．２ｋｂ的插入片断和长约９．３ｋｂ的载体片断，表明融合基因已经成功插入到载体ｐＰＩＣｇｋ中。
质粒测序结果显示，全部序列没有发生突变，与预期一致。
１．ＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＩＬ２ｍｌ２．ＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐＢｌｕｅ／ＨＳＡ，３．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＢＨＩｍｗｉｔｈＥｅｏＲＩ＃４．Ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓ—ｔｉｏｎｏｆｐＢＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏＲｌ／Ｎｏｔｌ；Ｍ．ＸＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ圈１重组质粒ｐＢＨｌｍ的酶切分析Ｆｉｇ．１ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＢＨｌｍ３．３阳性转化子的筛选及诱导产物的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定质粒ｐＰＨＩｍ经ＳａｌＩ酶切，回收线性化片断，电击转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌｌ５感受态细胞。
涂布ＭＤ平板，３０℃培养４ｄ后共长出了约４００个转化子，挑选其中２００个菌落进行初筛，选其中表达量较高的１０株重组菌进行复筛验证，得到一株产量最高的重组菌Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌｌ５／ｐＰＨＩｍ，诱导３ｄ后上清液的ＳＤ§ＰＡＧＥ分析和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果如图３所示。
３’ＡＩＬ２ｍ１．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＩＣ９ＫｗｉｔｈＥｃｏＲｌ；２．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏＲＩ；３．ＤｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏ—Ｒｌ／ＮｏｔＩ；Ｍ．）．ＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ图２重组质粒ｐＰＨＩｍ的物理图谱（Ａ）和酶切分析（Ｂ）Ｆｉｇ．２ＰｈｙｓｉｃａｌｍａｐＩＡ）ａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂ）ｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＰＨｌｍ研究发现，表达的蛋白质的相对分子质量约为８２０００，与理论计算ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的相对分子质量相符，且这一位置的蛋白与１１．－２、ＨＳＡ的抗体都能发生免疫反应，进一步证实酵母经诱导表达ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ。
但７００００和４５０００这两处的降解条带又都可以与ＨＳＡ的抗体发生免疫反应，认为是融合蛋白降解所产生的条带。
经白蛋白测定试剂盒测得其中白蛋白融合蛋白的量约为６０．２ｍｇ／Ｌ（以ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ计）。
３．４诱导产物的活性测定发酵液经脱盐处理后，冻干保存。
取０．１ｍｇ冻干粉用２ｍＬＰＢＳ复溶后，离心取上清，测得其中融合蛋白的量约为３００／－ｇ／ｍＬ。
采用ＩＬ－２依赖细胞株ＣＴＬＬ一２以标准品ＩＬ－２为对照，对上清液中的融合蛋白的生物学活性进行了测定。
标准品的活性为２×１０５ＩＵ／ｍＬ，用ＲＰＭｌｌ６４０稀释到浓度为２００ＩＵ／ｍＬ。
测定结果表明，上清液中的融合蛋白可以有效的刺激ＣＴＬＬ－２细胞增殖。
以标准品的最高浓度ＯＤ啪值为１００ｏ／６，计算标准品、样品梯度百分率。
将百分率换算为概率单位，以概率单位为纵坐标，以稀释度Ｘ的对数为横坐标，绘制直线回归图（图４），通过计算得出融合蛋白粗蛋白的比活性为１．５１×１０６ＩＵ／ｍｇ。
第４期金光泽等：重组融合人血清白蛋白一人白介素一２Ｃ１２５Ａ突变体在毕赤酵母中的表达５９９Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；１．ＦｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＨＳＡ—ＩＬ２ｍ；２．ＰｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌ１５／ｐＰＩＣ９ｋ３．ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ／ＩＬ２ａｎｔｉｂｏｄｙ。
４．ＨＳＡ～ＩＬ２ｍ／ＨＳＡａｎｔｉｂｏｄｙ图３融合蛋白ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析（Ａ）和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析（Ｂ）Ｆｉｇ．３ＳＤｓ．ＰＡＧＥ（Ａ）ａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ（Ｂ）ｏｆｔｈｅｆｕ－ｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＨＳＡ－ＩＬ２ｍ图４数据转换与线性回归的概率单位分析Ｆｉｇ．４Ｐｒｏｂｉｔｕｎｉｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｌｉｎｅａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄａｔａ３．５融合蛋白的摇瓶诱导条件初步优化３．５．１初始ｐＨ对表达量的影响配制ＢＭＭＹ培养基时，将初始ｐＨ值分别调至５．０、５．５、６．ｏ、６．５，种子液培养３６ｈ后，经离心，用相同体积的ＢＭＭＹ液体培养基重悬菌体，２００ｒ／ｒａｉｎ，３０℃培养，每隔２４ｈ补加体积分数１％甲醇，７２ｈ后将发酵液离心并取上清，测定其中融合蛋白的含量。
结果如图５（ａ）所示，该菌表达ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ的最适初始ｐＨ都在６左右，由于诱导培养基中含有０．１ｍｏｌ／Ｌ的磷酸钾缓冲液，测得的发酵液ｐＨ也基本在初始ｐＨ附近，因此可基本确定该菌的最适ｐＨ在６．０附近，这与Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的介绍相符。
３．５．２甲醇体积分数对表达量的影响配制ＢＭ—ＭＹ培养基时，将初始ｐＨ调至６，二级种子培养３６ｈ后，用相同体积的ＢＭＭＹ液体培养基重悬菌体，２００ｒ／ｍｉｎ，３０℃培养，每隔２４ｈ按体积分数补加１％，２％，３％，４％甲醇，７２ｈ后将发酵液离心并取上清，测定其中融合蛋白的含量。
结果如图５（ｂ）所示，甲醇添加量为３％时ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的表达量最高。
３．５．３转速对表达量的影响配制ＢＭＭＹ培养基时，将初始ｐＨ调至６，二级种子培养３６ｈ后，用相同体积的ＢＭＭＹ液体培养基重悬菌体。
分别采用旋转式摇床１５０、２００、２５０ｒ／ｍｉｎ，往复式摇床１００、２００ｒ／ｍｉｎ，３０℃培养，每隔２４ｈ按体积补加甲醇３％，７２ｈ后将发酵液离心并取上清，测定其中ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ的含量。
结果如图５（ｃ）所示，１００（Ｗ）、２００（ｗ）为往复式摇床转速），在装液量体积ｌｏ％条件下，随转速上升，表达量呈上升趋势。
相同转速下往复式摇床的溶氧要高于旋转式摇床，说明毕赤酵母在诱导期间对溶氧的需求量非常大，由于摇床转速的限制，确定最适的摇床转速为往复式２００ｒ／ｒａｉｎ。
３．５．４诱导相与生长相培养基体积比对表达量的影响配制ＢＭＭＹ培养基时，将初始ｐＨ调至６，二级种子培养３６ｈ后，用１：１、１：０．５、１：０．３倍体积的ＢＭＭＹ液体培养基重悬菌体，分别采用往复式摇床２００ｒ／ｒａｉｎ，３０℃培养，每隔２４ｈ按体积补加甲醇３％，７２ｈ后将发酵液离心并取上清，测定其中ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的含量。
结果如图５（ｄ）所示，该菌在１：０．５这个浓缩倍数下，表达量较高，在有充分的溶氧和合理的培养基的组分的情况下，随着细胞密度的增加，目的蛋白的表达量会逐渐增加。
由于本文研究的是在摇床条件下表达目的蛋白，当细胞密度达到一定值的时候，溶氧就成了限制菌体代谢和目的蛋白表达的重要因素，所以研究细胞密度对融合蛋白表达量的影响是有必要的。
重组融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达作者：金光泽， 段作营， 张莲芬， 金坚， 李华钟， JIN Guang-ze， DUAN Zu-ying， ZHANG Lian-fen， JIN Jian， LI Hua-zhong作者单位：金光泽,段作营,李华钟,JIN Guang-ze,DUAN Zu-ying,LI Hua-zhong(江南大学,工业生物技术教育部重点实验室)， 张莲芬,金坚,ZHANG Lian-fen,JIN Jian(江南大学,医药学院,江苏,无锡,214122)刊名：食品与生物技术学报英文刊名：JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：2010,29(4)被引用次数：4次1.Kim HP;Imbert J;Leonard W Both integrated and differential regulation of components of the IL-2/IL-2 receptor system[外文期刊] 2006(05)2.常志远;徐荻白细胞介素2的研究进展[期刊论文]-中国处方药 2004(8)3.蒋春雷;徐荻;郑仲承白细胞介素-2的中枢镇痛作用[期刊论文]-中国应用生理学杂志 1994(04)4.Alice KP;Jorge AT Therapeutic use of interleukin-2 in HIV-infected patients[外文期刊] 2002(4)5.Grace Ju;Lisa C;Kimberlee L Structure-Function analysis of human interleukin-2 1994(12)6.李洁;张莲芬;孙均铭人C-型利钠肽-血清白蛋白融合蛋白质的构建及在毕赤酵母中的分泌表达[期刊论文]-中国生化药物杂志 2007(05)7.Version E;Carlsbad CA Multi-copy Pichia Expression Kit 19998.周道洪;沈元珊;赵曼瑞测定淋巴细胞转化和鼠白细胞介素2活性的新方法--MTT比色分析法 1986(01)9.Samrook J;Pritsch EF;Maniatis T Molecular cloning:a laboratory manual 199010.Scorer CA;Buckholz RG;Clare JJ The intracellular production and secretion of HIV-envelope protein in the methylotropic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 199311.Roberts M J;Bentley MD;Harris JM Chemistry for peptide and protein PEGylation 2002(04)12.郭美锦;庄英萍;储炬重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达rHSA[期刊论文]-微生物学报 2002(01)1.张琦人β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白的高产菌株筛选及制备工艺[学位论文]20092.王舒.郑志永.詹晓北.史仲平.高敏杰.刘立明.金坚.李华钟.Wang Shu.Zheng Zhiyong.Zhan Xiaobei.Shi Zhongping.Gao Minjie.Liu Liming.Jin Jian.Li HuaZhong重组毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白过程的代谢特性[期刊论文]-食品与发酵工业2008,34(8)3.郭泽峰.段作营.张莲芬.金坚.李华钟.GUO Ze-feng.DUAN Zuo-ying.ZHANG Lian-fen.JIN Jian.LI Hua-zhong 人白介素-2/人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达[期刊论文]-中国药科大学学报2008,39(1)1.李波.段作营.张红梅.雷楗勇.陈蕴.唐瑜菁.金坚.李华钟人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白的纯化及活性鉴定[期刊论文]-食品与生物技术学报 2012(3)2.罗文.雷楗勇.金坚重组人白细胞介素2-人血清白蛋白融合蛋白的液态稳定性[期刊论文]-食品与生物技术学报2013(2)3.钱凯.雷楗勇.关波.陈蕴.饶志明.金坚人血清白蛋白和干扰素α2b融合蛋白在毕赤酵母中表达及质量控制[期刊论文]-食品与生物技术学报 2012(12)4.张慧敏.李剑芳.邬敏辰.魏喜换.杨严俊耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质[期刊论文]-食品与生物技术学报 2013(2)引用本文格式：金光泽.段作营.张莲芬.金坚.李华钟.JIN Guang-ze.DUAN Zu-ying.ZHANG Lian-fen.JIN Jian.LI Hua-zhong重组融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达[期刊论文]-食品与生物技术学报 2010(4)。