• 金属螯合剂:亚氨二醋酸、氨基水杨酸、 羟基喹啉、羧甲基氨基酸等 .
• 蛋白质上的氨基酸残基，如组氨酸的咪 唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚 基，利于蛋白质与固定化金属离子结合。
• 金属离子如锌和铜。

• 吸附：在。 • 洗脱：降低值、增加离子强度、或在缓冲
液中加 等方法。
• 特点： • 蛋白质吸附容量大。 • 价格便宜。 • 具有普遍适用性。
•
②偶联条件温和。
•
③偶联效率高。
双功能试剂法
• 双功能试剂是同一分子中具有两个反应活性基团的 化学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁”。
• 二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐 • 优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、
酚、醇类等偶联。 •
（二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其它凝胶衍生物活化与偶联
• 叠氮化法
第一节 亲和层析 ()
• 利用生物大分子物质具有与某些相应 的分子专一性可逆结合的特性而建立 的层析技术。
• 适用于从成份复杂且杂质含量远大于 目标物的混合物中提纯目标物。
特点
• 经过一次处理可得到高纯度活性物质 。 • 设备要求不高、操作简便、特异性强、分离速度
快、分离效果好、分离条件温和。 • 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
应用受到限制。
• 、聚丙烯酰胺凝胶： • 有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较
高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 • 过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
• 、多孔玻璃珠： • 化学与物理稳定性较好，机械强度高。 • 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性
蛋白质有非特异性吸附，化学活性基团少。
• 、其它载体——壳聚糖
亲和吸附剂：载体—配基
• 在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （）。
• 与配基结合的层 析介质称为载体 （）。
一、亲和层析的原理
• （）配基固定化：配基与 载体偶联，结合成具有特 异亲和性的分离介质。
• （）吸附样品：亲和层析 介质选择性吸附生物活性 物质.
• （）样品解吸：选择适宜 的条件使被吸附物活性物 质解吸。
• 为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值≥。 • 配基浓度与亲和对解离常数相关。 • 对于低亲和力系统，配基浓度。
（二）、空间障碍的影响
• 空间位阻。 • 对于分子大的配体以及小
分子配基更明显。
• “手臂”，增加与载体相 连配基的活动度，减轻载 体的立体障碍。
• 常用的“手臂”多为烃链。
（三）、配基与载体的结合位点的影响
• 用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 • 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。
碳二亚胺缩合法
• 碳二亚胺为 羧基活化剂。
• 反应中的脲 衍生物可用 有机溶剂洗 涤除去。
（三）、用于固定化配基的凝胶衍生物
、活化的 经活化，可偶联蛋白和核酸类配基。
、和 含有个碳原子的”手臂”的琼脂糖衍生物 用于含有羧基的一类配基。 能与含有一级氨基的配基偶联。
• 多肽或蛋白质等大分子配基
• 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能 基团与载体连接。
• 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附 剂具有较大的亲和力。
• （四）、载体孔径的影响 • 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 • 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。
• （五）、微环境的影响 • 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 • 避免引入离子键的基团。 • 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。
、纤维素
• 纤维素结构紧密、均一性差，不利于大 分子的渗入。
• 非特异性吸附力较强，空间位阻。
• 主要用于分离与核酸有关的物质。
、琼脂糖凝胶
• 琼脂糖浓度有、、，商品为 、和（）。 • 保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种
功能基团，结构疏松孔径大，流速快。 • ,稳定性明显增加，能在中应用。
• 、葡聚糖凝胶： • 葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，
第二节 其他亲和纯化技术
一、亲和过滤（膜分离） 二、亲和分配（双水相萃取） 三、亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 四、亲和沉淀（沉淀分级） 五、亲和电泳（电泳）
一、 亲和过滤（ ）
• 将亲和层析和膜过滤技术结合运用，包括 亲和错流过滤和亲和膜分离。
• 亲和错流过滤（ ）: 是将亲和层析与 超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的 亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲 和层析与膜过滤的优点。
第九章 亲和纯化技术
• 利用生物分子间的特 异性结合作用的原理 进行生物物质分离纯 化的技术称为亲和纯 化技术（ ）
技术要点
• （）找与底物专一可 逆结合的配基。
• （）将配基通过共价 键偶联到基质。
• （）配基与底物吸附； • （）洗脱目标物。
亲和纯化技术
• 亲和层析( ) • 亲和过滤（膜分离） • 亲和分配（双水相萃取） • 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） • 亲和沉淀（沉淀） • 亲和电泳（电泳）
• 洗脱方法主要有三种：
•
非专一性洗脱
•
特殊洗脱
•
专一性洗脱
非专一性洗脱
• 改变洗脱剂的。 • 离子强度的分步和梯度变化.
• 亲和势很高，促溶离子，其洗脱能力的强弱顺序 －<－<－<－ <－。
• 用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍）。
特殊洗脱
• 裂解配基与载体的连接键。
• 断裂方法有： • 硫酯键用羟胺处理分钟。 • 偶氮键用连二亚硫酸钠硼酸缓冲液处理。 • 二硫键用巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏
速有关。
• 温度升高会使吸附作用减弱。 • 流速每小时低于 。 • 层析柱用前必须充分平衡。 • 上样体积为柱床体积的。
非专一性吸附
• 亲和层析中的非专一性吸附。
•
离子效应
•
疏水基团
•
复合亲和力
离子效应
• 配基与载体间隔臂的不 完全结合，将无关离子 基团引入吸附剂。
• 具有离子基团的亲和吸 附剂会影响蛋白质的洗 脱行为。
壳聚糖(甲壳素和壳聚糖)
三 、 亲和配基
• 配基的选择 • 配基的浓度 • 配基偶联的位置 • 配基分子的大小 • 配基的类型
（一）、配基的选择
• 亲和层析配基的选用主要取决于分离对 象。
• • 、配基与配体有足够大的亲和力 （亲
和势）， 在～之间。 • 、配基与配体的结合应是专一的 。 • 、配基应具有化学活性 。
亲和错流过滤 （）
• 基质及大分子亲和配基 • 基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内
核表面。配基对提取的目标物进行专一可逆的 吸附，形成复合体。
• 用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨 大可被保留，杂质随液体透过膜，目标物与其 它成分分离。
基质
• 聚丙烯酰胺
• 菌类的完整细胞 （酵母、芽胞杆菌、 链球菌等细胞）
、生物胶、亲和胶和亲和胶
• ，无“手臂” 的羧基衍生物。 • 具有个原子“手臂”，未端为氨基。 • 具有个原子的“手臂”，未端具有羧基。
五、 影响吸附亲和力的几个因素
• 配基浓度对亲和力的影 响
• 空间障碍的影响 • 配基与载体的结合位点
的影响 • 载体孔径的影响
（一）、配基浓度对亲和力的影响
• 多糖载体与的高碘酸钠氧化反应小时会产生醛。 • 在温和条件下，醛与赖氨酸上的ε生成西夫碱，
接着用硼氢化钠还原，生成稳定的烷基胺。
环氧化法
• 碱性条件下，多糖载体与环氧氯丙烷作用 生成环氧化合物。
• 环氧化合物又与氨基酸或蛋白质上氨基偶 联。
甲苯磺酰氯法
• 甲苯磺酰氯法
• 在无水丙酮中进行。
• 优点：①活化反应迅速。
亲和势—（复合物的解离常数 ）
•
（二）、配基的浓度
• 对亲和势比较低的时候（≥），增加配基 浓度有利于吸附。
• 增加亲和柱的长度来提高吸附率。 • 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 • 理想的配基浓度为μ。
（三）、配基偶联的位置
• 配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。
• 亲和柱 • 腺嘌呤氨基接到载体上，对脱
• 重氮化法 (含氨基载体) • 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）
聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
• 有大量可修饰的酰胺基。 • 酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。
叠氮化法
• 聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加的亚硝酸， 反应液搅。
• 加入脂肪胺类配基，制得亲和吸附剂。
重氮化法
• ω氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得对 硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。
六、 配基与间隔臂的连接
• （一）、含氮配基的连接 • （二）、含羧基配基的连接 • （三）、含巯基配基的连接 • （四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接
七、 亲和层析的吸附和洗脱
• 影响吸附的条件 • 亲和层析的洗脱 • 亲和吸附剂的再生
（一）、影响吸附的条件
• 亲和吸附剂及配体的性质 • 缓冲液的种类、离子强度、、温度和层析流
糖醇等处理。
专一性洗脱
• （固定化配基），（酶），（游离配基） • （）竞争性效应，即不如稳定，增加洗脱剂中，
会使洗脱下来（正洗脱）。 • （）当稳定性与相同时，的存在并不影响对的
结合，非竞争性效应。 • （）反竞争性效应，即比稳定，使与结合更紧
密（负洗脱） 。
反竞争性效应
亲和层析中配基的选择和洗脱条件
氢酶和甘油激酶有吸附力。 • 磷酸基接到载体上，对甘油醛
磷酸脱氢酶有吸附力。
（四）、配基分子的大小
• 选用大分子配基。
• 甘氨酸 • 小分子物质作为配基，
载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
（五）、配基的类型