核酸化学及研究方法一、名词解释1.正向遗传学：通过研究突变表型确定突变基因的经典遗传学方法。

2.核小体组蛋白修饰：组成核小体组蛋白，其多肽链的N末端游离于核小体之外，常被化学基团修饰，修饰类型包括：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化，修饰之后会改变染色质的结构和活性。

3.位点特异性重组：位点特异性重组是遗传重组的一类。

这类重组依赖于小范围同源序列的联会，重组只发生在同源短序列的范围之内，需要位点特异性的蛋白质分子参与催化。

4.转座机制：转座酶上两个不同亚基结合在转座子的特定序列上，两个亚基靠在一起形成有活性的二聚体，切下转座子，转座酶-转座子复合物结合到靶DNA上，通过转座酶的催化将转座子整合到新位点上。

5.基因敲除：利用DNA同源重组原理，用设计的外源同源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的靶基因发生重组，从而将外源DNA整合到受体细胞的基因组中，产生精确的基因突变，完成基因敲除。

6.Sanger双脱氧终止法：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在的条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，若双脱氧碱基掺入链端，该链便停止延长，若单脱氧碱基掺入链端，该链便可继续延伸。

如此每管反应体系中便合成了以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。

反应终止后，分四个泳道进行电泳，以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

7.荧光实时PCR技术原理探针法：TaqMan探针是一小段可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，它的5’和3’端分别带有一个荧光基团，这两个荧光基团由于距离过近，相互发生淬灭，不产生绿色荧光。

PCR反应开始后，靶DNA变性，产生单链DNA，TaqMan探针结合到与之配对的靶DNA序列上，之后被Taq DNA聚合酶切除降解，从而解除荧光淬灭，荧光基团在激发光下发出荧光，最后可根据荧光强度计算靶DNA的数量。

染料法：荧光染料（如SYBR GreenⅠ）能与双链DNA发生非序列特异性结合，并激发出绿色荧光。

PCR反应开始后，随着DNA的不断延伸，结合到DNA上的荧光染料也相应增加，被激发产生的荧光也相应增加，可根据荧光强度计算初始模板的数量。

8.双分子荧光互补(BiFC)技术原理将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N片段和C片段。

这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，不能产生荧光。

但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到一组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这两个目标蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光。

简言之，如果目标蛋白质之间有相互作用，则在激发光的激发下，产生该荧光蛋白的荧光。

反之，若目标蛋白质之间没有相互作用，则不能被激发产生荧光。

二.问答题：1.怎样将一个基因克隆到pET32a载体上；原核表达后，怎样纯化该蛋白？2.通过哪几种方法可以获得cDNA的全长？简述其原理。

（一）已知序列信息1.同源序列法：根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计简并引物，利用简并引物进行RT-PCR扩增，得到该基因的部分cDNA序列，然后再利用RACE（cDNA末端快速扩增技术）获得cDNA全长。

2.功能克隆法：cDNA文库；基因组文库（二）未知序列信息：1.基于基因组DNA的克隆：是在鉴定已知基因的功能后，进而分离目标基因的一种方法。

(1)图位克隆；（2）T-DNA标签法和转座子标签法3.什么是DNA探针、种类及标记的方法有哪些？DNA探针：人工合成的带有放射性或生物素标记的单链 DNA 片段，它能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后可用特殊方法检测。

探针种类：⑴基因组DNA探针：它是某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列；⑵cDNA探针：以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链；⑶RNA探针：以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA；⑷寡核苷酸探针：人工合成的碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段。

探针标记方法：⑴随机引物法：寡核苷酸引物与已变性的DNA单链结合，在大肠杆菌DNA聚合酶I 的Klenow片段作用下，以同位素标记的dNTP为原料，从3'-OH端开始沿5'至3'方向延伸，合成一条与模板互补的新DNA链。

⑵切口平移法：利用微量的胰DNA酶Ⅰ使待标记的双链DNA分子产生若干切口，然后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的5'→3'外切酶活性从切口的5'端除去核苷酸;同时利用该酶5'→3'的聚合酶活性将反应体系中的核苷酸底物连接到切口的3'羟基末端。

由于切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,此时若反应体系中含有标记的核苷酸，它们就会掺入到新合成的链中，获得带有标记的DNA探针。

⑶末端标记法：分为5'端标记法和3'端标记法。

5'端标记法：用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5'末端的磷酸基团，使其成为5'-OH，然后经T4噬菌体多苷酸激酶催化，将（ATP-γ35S）γ位上的35S转移到DNA或RNA分子的5'-OH末端，使DNA片段5'端带有35S标记。

3'端标记法：利用TdT 在DNA的3'末端掺入SH-GTP，因-SH不稳定，常用顺丁烯二酰亚胺进行偶联反应4.哪些方法可以检测转录水平(mRNA水平)的表达差异？简述原理。

1.Northern印迹杂交。

原理：基因若能正常表达，细胞内会有特异mRNA的生成。

将提取的mRNA用变性凝胶电泳分离，不同的mRNA分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上，之后将他们原位转移到固定膜上，在适宜的离子强度及温度条件下，将DNA探针与特异mRNA进行杂交，杂交带的宽度越宽和亮度越大，表明mRNA的表达水平越高。

2.荧光实时定量PCR。

原理：基因若能正常表达，细胞内会有特异mRNA的生成。

将提取的mRNA逆转录成cDNA，补齐成双链DNA后，在具有荧光探针的体系中进行PCR。

荧光强度越高，表明cDNA量越多，也就表明mRNA 的表达水平越高。

3.RT-PCR。

原理：将一条mRNA链逆转录成为cDNA，补齐成双链DNA后，通过PCR进行DNA扩增，将扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据条带的有无，确定某种mRNA表达与否。

4.基因芯片:原理：将大量已知序列的核酸片段集成在同一基片上，组成密集分子排列的基因芯片，然后用mRNA 反转录出的cDNA与已知核酸片段进行杂交，根据杂交信号的强弱，检测出mRNA表达水平的高低。

5.试述绿色荧光蛋白的结构特征及其在分子生物学中的应用。

绿色荧光蛋白的结构特征：荧光蛋白具有238个氨基酸残基，其中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，三维结构由11个反向平行的β-折叠环绕成1个桶状结构，一个较长的α-螺旋从桶的中心穿过，这些β-折叠和α-螺旋之间通过Loop环连接起来。

GFP的发色团位于桶中心的α-螺旋上，由荧光蛋白通过自体催化，将3个氨基酸残基Ser65-Tyr66-Gly67进行环化。

GFP蛋白在分子生物学中的应用：1.GFP作为报告基因用于转基因研究；2.GFP作为报告蛋白用于基因表达调控效果的研究；3.GFP融合蛋白用于研究蛋白质的定位、迁移和相互作用；4.CFP用于对细胞的追踪。

6.试述RNA沉默的机理及其应用。

RNA沉默的机理：将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的dsRNA导入细胞后，dsRNA会被一种名为Dicer的酶识别，并将dsRNA加工成21nt的小片段。

之后，这些小片段与RNA沉默复合体（RISC）结合，RISC除去其中一条链，留下另一条链与自己结合在一起。

接着，RISC寻找与自己携带的RNA 匹配的mRNA分子，一旦发现，就会与该mRNA结合，发生特异性的降解，导致产生相应的基因沉默。

RNA沉默的应用：⑴基因消减：利用RNAi会降低或停止目标基因的表达；⑵作物品质改良；⑶产生抗病毒植物：植物可利用PTGS（转录后基因沉默）来抵抗病毒侵染。

7.试述CRISPR/Cas系统结构、CRISPR/Cas技术的原理及应用？CRISPR/Cas系统结构：它包括一个前导区、多个短而高度保守的重复序列区、多个间隔区以及一系列与CRISPR相关的蛋白的基因cas。

细菌体内CRISPR/Cas作用原理：（1）CRISPR的高度可变的间隔区的获得：外来入侵的噬菌体或质粒DNA进入细菌体内后，它们的一小段DNA序列会被整合到宿主菌的基因组中，整合的位置位于CRRSPR的两个重复序列之间的间隔区。

（2）CRIPSR基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)：CRISPR基因座被转录成前体pre-RNA，然后由tracrRNA(与pre-crRNA重复序列互补的序列)指导，在Cas蛋白或是核酸内切酶的作用下，pre-RNA被剪切成一些小的RNA单元，这些小RNA即为成熟crRNA。

（3）CRISPR/Cas系统发挥活性，对外源遗传物质的干扰：成熟的crRNA与特异的Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物，再与外源DNA结合并扫描到外源DNA，寻找其上的靶序列，crRNA的间隔序列与靶序列互补配对，外源DNA在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割。

CRISPR/Cas技术用于敲除基因原理：根据待敲除基因的上下游的DNA序列分别设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将向导RNA的基因（相当于是细菌间隔区的基因）与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，转录加工后，向导RNA（相当于crRNA）与Cas9蛋白结合，之后通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，对目标序列进行切割，从而切断待敲除基因上下游的DNA双链，实现基因敲除。

CRISPR/Cas技术的应用：作为一种新的基因编辑技术，可以对动植物、微生物的基因进行修饰，具有多样的基因调控方式，例如敲除、插入、抑制、激活等。

8.哪几种方法可以检测蛋白质和DNA之间的相互作用，简述原理。

（1）酵母单杂交技术（yeast one-hybrid）技术原理：GAL4是酵母自身的转录因子，该蛋白质包括两个结构域：DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD），两结构域可完全独立地发挥作用，BD区负责与顺式作用元件的结合，AD区负责激活启动子。

利用这一特性，我们可以用酵母单杂交技术来检测蛋白质和DNA之间的相互作用。