高效液相色谱（HPLC）法测定邻苯二甲酸酯一、实验目的：1.了解高效液相色谱仪原理；2.学习高效液相色谱仪的基本操作方法；3.利用高效液相色谱仪测定邻苯二甲酸酯、邻苯二乙酸酯、邻苯二丁酸酯的峰图和含量。
二、实验原理：①高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
高效液相色谱法有“四高一广”的特点：高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广。
该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。
反之，则称为正相色谱分离系统。
反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(W1＋W2)//式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间；t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。
除另外有规定外，分离度应大于1.5。
②本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。
它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。
但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。
同时也有一定的致癌作用。
如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂1、仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。
2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水，样品。
出峰次序样品组成1 邻苯二甲酸二甲酯（DMP）2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP)3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)四. 实验步骤1、色谱条件色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）柱温：室温流动相：（初始）高纯水：30％，甲醇：70％检测器：DAD检测器;检测波长：220nm、254nm；进样体积：20µl定量环，实际注射每次可控制在20µl以上。
2、待测溶液的组成首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。
然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。
3、色谱测定(1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。
流量为1.000ml/min。
(2) 待仪器稳定后，开始进样。
将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。
(3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。
(4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。
依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。
五.实验结果和分析（均以220nm为准）（1）混合样品：流动相的比例为：高纯水：20%甲醇：80%，流速为1ml/min，记录色谱图，并计算分离度；如图：从图中看出三种物质基本分离，但邻苯二甲酸甲酯和邻苯二甲酸乙酯分离程度不够，还是有稍许重叠。
计算分离度为1.494和6.282，这与图谱中显示的基本吻合。
（2）邻苯二甲酸乙酯样品：流动相的比例为：高纯水：20%甲醇：80%，流速为1ml/min，记录色谱图，并计算分离度；如图：图中高峰出现在 4.87min，这与第一张图中邻苯二甲酸乙酯出现的时间（4.81min）基本重合，可以判断这是邻苯二甲酸乙酯。
其他的峰可能是残留的邻苯二甲酸甲酯（2.205min）或者波动。
（3）混合样品：流动相的比例为：高纯水：30% 甲醇：70%；流速为1ml/min，记录色谱图，并计算分离度；如图：降低甲醇的比例后发现前两者分离度更大，但明显出峰时间延长。
分离度分别为：2.80和12.48.（4）混合样品：流动相的比例为：高纯水：20％，甲醇：80％，流速为0.5ml/min，记录色谱图，并计算分离度；如图：降低流速后分离度有所增加，但出峰时间明显延长。
两者分离度为：1.71和7.55。
（5）混合样品梯度洗脱：流动相的比例：（0-2.5min高纯水：30%甲醇：70%；2.5-8.5min高纯水：15%甲醇：85%），流速为1ml/min，记录色谱图，并计算分离度。
如图：改为梯度洗脱后，先采取30%-70%时，明显前面两者分离度增加。
而改变梯度（比例）为15%-85%后，出峰时间明显缩短。
同时由于增加了梯度洗脱过程中甲醇比例，导致有一个基线上升的过程。
经过计算，两者分离度分别为2.95和8.23。
六、体会：实验原理：本实验是反相色谱柱，溶剂为极性溶剂，固定相为C8非极性物质，待测物质为相似度大的三种酯。
所以降低甲醇的比例就会增加极性，待测物质跟随冲洗液流出的能力下降，从而使得出峰时间延长，分离效果更好。
而降低流量则待测物质被流动相带走的可能下降，分离度会有所增加。
所以本实验需要调节流量和比例来测定分离度的不同。
梯度洗脱原理：利用不同比例流动相对分离度和出峰时间的影响（往往是相反的作用）。
通过程序设定，不同时间（不同物质）来设定流动相中甲醇和水的比例，既达到较好的分离度，又能缩短不必要的时间。
如本实验中，根据前面时间得到的比例和出峰时间，最开始4min 内甲醇和水的比例为70-30%，以促进邻苯二甲酸甲酯和邻苯二甲酸乙酯的分离，而4-8.5min 内，则增加了甲醇比例（85-15%），缩短邻苯二甲酸丁酯出峰的时间。
操作注意：1.本实验采用紫外来做检测器，设定的光波长为220nm，但由于短波长对杂质敏感，所以会采用254nm紫外光来做对比和看稳定性。
而从图中也可以看出，理论和实际相符，220nm图中容易出现小的峰和波动。
2.实验前后需要用甲醇-水（60-40%）、甲醇-水（70-30%）...直到纯甲醇来清洗系统和色谱柱，并保证柱压稳定在标准值。
3.实验开始前需要用3ml/min甲醇（流动相）来冲气泡。
4.用50uL注射器抽取液体时，要保证没有气泡（影响峰的大小和理论含量），同时每次最好抽取过量再排出液体至20uL。
七. 思考题（1）比较图2和图3可知，在缓冲液作流动相的情况下，实验得出的峰形较好。
但为什么实验室尽量不用缓冲溶液作流动相？图2 缓冲液作流动相得出的色谱图图3 乙腈-水（5：95）作流动相得出的色谱图答：因为缓冲液往往为酸碱盐溶液，而这种体系会导致固定相（如C8键合物质）的塌陷，失去作用。
尤其是纯的水和盐、酸、碱溶液长时间流过色谱柱可能造成色谱柱填料被化学破坏，这种对色谱柱固定相及键合相的破坏通常是不可修复的。
（2）流动相在使用前为什么要用砂芯漏斗过滤？答：待测样品中可能会有颗粒物和杂质，色谱柱由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。
对于仪器，溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。
所以尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加（3）请分析实验结束后，怎样清洗柱子。
分为两种情况，第一种情况为流动相用到缓冲溶液，第二种情况为流动相不用缓冲溶液？答：1. 对于使用过缓冲液的柱子，必须先将体系中盐分去除干净，然后再以强溶剂清洗。
通常可以同浓度但不含缓冲液成分的流动相洗20倍柱体积，亦可直接以纯水洗至柱内无盐后再改换成强溶剂洗脱。
要确保缓冲溶液与冲洗溶剂互溶。
如果不能互溶，首先要用水含量相对较高的溶剂冲洗系统和色谱柱，然后再用冲洗溶剂替换。
2. 对于不用缓冲溶液：以20倍柱体积或更多一些的强溶剂加以清洗。
例如，90%~100%的甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃等。
如果效果不理想，则可换用更强的溶剂清洗，例如，将系统逐步置换至乙酸乙酯、异丙醇、氯仿、烃类（如己烷、庚烷等）。
也可以在甲醇、乙腈等水溶性溶剂之后，改用50%DMSO或DMF水溶液加以清洗。
清洗几十倍柱体积后，再逐步置换返回原系统（4）根据实验结果分析，流动相中水的比例多少对分离度、出峰时间的影响及流速对分离度的影响。
答：见实验结果和分析。
水的比例增加会使得流动相极性增加，分离度增加，出峰时间增加。
而流速减小，分离度略有增加，出峰时间延长。
八、参考文献：讲义、《分析化学原理》-吴性良孔继烈/html/201209/4757030.html/question/475242456.html（注：实验图谱见下页）图谱：80%水-20%甲醇-1.0ml/min混合样品图谱：80%水-20%甲醇-1.0ml/min-邻苯二乙酸酯图谱：梯度洗脱：0-2.5min高纯水：30%甲醇：70%；2.5-8.5min高纯水：15%甲醇：85%，流速为1ml/min。