第41卷第1期华中师范大学学报(自然科学版)Vol.41No.12007年3月 J OU RNAL OF HUAZHON G NORMAL UNIV ERSIT Y (Nat.Sci.) Mar.2007收稿日期:2006210220.基金项目:国家自然科学基金资助项目(20274034);西北师范大学博士科研启动基金资助项目.3Email :nwnuming @.文章编号:100021190(2007)01201172034种植物多酚对生物大分子的保护作用刘国安3,杨庆明,杨　红,丁　兰,候国鹏(西北师范大学生命科学学院,兰州730070)摘　要:为了研究多酚类化合物对生物大分子氧化损伤的保护作用,采用MDA 测定、SDS 2PA GE 、琼脂糖电泳,检测了4种多酚对由自由基引起的脂质过氧化、蛋白质氧化降解、DNA 断裂的保护作用.结果表明:槲皮素在抑制脂质过氧化中作用最突出,在保护蛋白质氧化降解中香草醛作用最强;芦丁在保护DNA 的氧化性损伤中最有效.说明4种化合物在不同的抗氧化体系中有不同的活性.关键词:植物多酚;脂质过氧化;蛋白质氧化;DNA 损伤;抗氧化作用中图分类号:R963文献标识码:A 自由基是人体中的正常代谢产物,如果自由基产生过多或清除过少,过量的自由基就会攻击生物大分子,导致细胞结构和功能破坏.因此,自由基是人类衰老和许多疾病如肿瘤、心脑血管病等的重要诱因[1].寻找能够有效清除自由基而无毒副作用的抗氧化剂,预防和减轻上述疾病的发生和发展,是研究的重要课题之一.本实验用丙二醛(MDA )测定、蛋白质凝胶电泳、DNA 电泳技术,测定了槲皮素、芦丁、香草醛、姜黄素对脂质过氧化、蛋白质和DNA 的氧化损伤的保护作用,并对其保护作用进行了比较和分析,为进一步研究抗氧化机理及临床应用提供理论基础.1材料与方法1.1试剂槲皮素、姜黄素、AA P H (2,22偶氮二(22脒基丙烷)二盐酸盐)、B H T (2,62二叔丁基对甲基苯酚)、琼脂糖、溴化乙锭均购自Sigma ,芦丁为西安惠丰生物工程公司产品,牛血清白蛋白(BSA )、质粒pBR322DNA 均购自华美生物工程公司,十二烷基磺酸钠(SDS )购自Serva ,实验用鼠由甘肃省肿瘤医院动物房提供,其余试剂均为国产分析纯.1.2脂质过氧化的测定微粒体的制备参照文献[2]的方法.Lowry 法测定蛋白质浓度.脂质过氧化的测定参照文献[3],稍作修改.1mL 反应体系中含有0.2mol/L PBS ,240～400μg 的微粒体蛋白,加入0.1m mol/L 抗坏血酸及10μmol/L FeSO 4启动反应.于37℃振荡孵育1h后,1.0mL 20%三氯醋酸终止反应,硫代巴比妥酸法测定MDA ,所有实验重复3次.1.3蛋白质氧化实验方法蛋白质氧化测定按H.Y.Kwon 等[4]的方法稍加改进.10μg 牛血清白蛋白(BSA )的氧化在0.2mol/LPBS 中由水溶性偶氮引发剂20m mol/L AA P H 启动.加入不同浓度的待测物.37℃水浴孵育24h 后,加入0.02%B H T 以防止氧自由基的进一步形成.样品按常规SDS 2PA GE 电泳,0.05%考马斯亮蓝R 2250染色.1.4D NA 氧化断裂实验方法pBR322质粒DNA 主要以超螺旋型存在,当受到氧化损伤时,质粒超螺旋的DNA 会打开1条核酸链而降解为环状,当损伤程度进一步加强时,2条核酸链会被同时打开而降解为线型的DNA ,电泳后位于超螺旋和开环之间[5].将100ng pBR322质粒DNA 与溶于0.15mol/L PBS 的10m mol/L AA P H 混匀,使终体积为25μL ,37℃孵育1h.抗氧化剂在加入AA P H 之前加入.孵育后立即上样电泳.0.8%琼脂糖凝胶以TA E 缓冲液(40m mol/L Tris 、20m mol/L 冰乙酸、2m mol/L ED TA p H118　华中师范大学学报(自然科学版) 第41卷8.0)配制.于1μg/mL EB 中染色30min ,于凝胶成像分析系统中观察照相.2结果2.1对脂质过氧化的保护作用槲皮素对脂质过氧化具有较强的抑制作用(IC 50=5.1μmol/L );芦丁(26.0)和姜黄素(26.9±)相近;香草醛的抑制作用最弱(表1).表1　槲皮素、芦丁、香草醛和姜黄素对脂质过氧化的保护作用( x ±s ,n ≥8)Tab.1　protections of lipid peroxidation by quercetin ,rutin ,vanillin and curcumin抗氧化剂IC 50/(μmol ・L -1)槲皮素 5.1±0.5芦　丁26.0±2.3姜黄素26.9±1.6香草醛89.1±11.02.2对蛋白质氧化的保护作用在10m mol/L AA P H 引发的氧化体系中,香草醛(V )对BSA 的保护作用最强,当浓度为12.5μmol/L 时,即有微弱的保护作用(图1D ).当浓度为50μmol/L 时,芦丁(R )和槲皮素(Q )出现与12.5μmol/L 的香草醛相同的保护作用(图1F ).当浓度升高时,芦丁的保护作用较槲皮素强(图1H 、I ).姜黄素(C )对BSA 的保护作用最弱,在800μmol/L 时才具有微弱的保护作用(图1H ).所以其保护作用从强到弱的顺序为V >R >Q >C.图1　槲皮素(Q )、芦丁(R )、香草醛(V )和姜黄素(C )对20m mol/L AAP H 引起的BSA 氧化的保护作用Fig.1　Protection of BSA oxidation induced with 20m mol/L AA P H by quercetin (Q ),rutin (R ),vanil 2lin (V )and curcumin (C )A :BSA ;B :20m mol/L AAP H +BSA ;　Q 、R 、V :C —I :20m mol/L AAP H +BSA +6.25、12.5、25、50、100、200、400μmol/L ;　C :C —I :20m mol/L AAP H +BSA +25、50、100、200、400、800、1600μmol/L.2.3对DNA 氧化的保护作用如图2、3所示,在10m mol/L AA P H 引发的氧化体系中,芦丁对质粒pBR322DNA 超螺旋的保护作用最强,当浓度为6.25μmol/L 时,即开始有保护作用(图2J ),而在同样的浓度下,其它几种化合物均没有保护作用.当浓度为12.5μmol/L 时,槲皮素(图2F )和香草醛(图3D )的保护作用与6.25μmol/L 的芦丁相同.姜黄素对质粒DNA 超螺旋的保护作用最弱,在100μmol/L 时才具有微弱的保护作用(图3J ).故在对DNA 的保护作用,其由强到弱的顺序是:R >Q =V >C.图2　槲皮素(Q )和芦丁(R )对10m mol/L AAP H引起的pBR322DNA 链断裂的保护作用Fig.2　Protection of pBR322DNA strand breakage inducedwith 10m mol/L AA P H byquercetin and rutin A :pBR322DNA ;B :pBR322DNA +10m mol/LAA P H ;C —G:10m mol/L AA P H +1.56、3.125、6.25、12.5μmol/L Q 、25μmol/L Q ;H —L :10m mol/L AA P H +1.56、3.125、6.25、12.5、25μmol/LR.图3　香草醛(V )和姜黄素(C )对10m mol/L AA P H引起的pBR322DNA 链断裂的保护作用Fig.3　Protection of pBR322DNA strand breakage induced with 10m mol/L AA P H by vanillin and curcumin A 、G:pBR322DNA ;B 、H :pBR322DNA +10m mol/L AA P H ;C —F :6.25、12.5、25、50μmol/L V ;I —L :50、100、200、400μmol/L C.3讨论多酚类化合物广泛分布于植物次生代谢产物中,具有较强的清除自由基和抗氧化的能力[6].槲皮素和芦丁是具有清除O 2-・和HO ・作用的黄酮类化合物.低浓度槲皮素和芦丁可明显减少由丝裂霉素C 诱导的DNA 链断裂损伤,但当浓度升高时,均失去保护作用[7].本实验中,在保护脂质过氧化时,槲皮素的作用明显强于芦丁,而在保护蛋白质氧化降解和DNA 断裂损伤时,芦丁则强于槲皮素.但在细胞体系中[8],低浓度的槲皮素对由H 2O 2引起的DNA 损伤具有明显的作用.而芦丁在浓度为50μmol/L 时仍然无保护作用.所以,槲　第1期刘国安等:4种植物多酚对生物大分子的保护作用119皮素和芦丁虽同为结构相似的黄酮化合物,但在不同的体系中,抗氧化性明显不同.从结构上看,二者不同的是槲皮素在C环上含32羟基,而芦丁C环的3位上被O2芸香糖所取代,这可能是造成二者在不同体系中对生物大分子氧化的保护作用不同的原因.姜黄素药理作用广泛,具抗氧化、抗炎等活性.香草醛是医药化工中重要的原料或中间体.关于姜黄素和香草醛抗氧化性的报道较少.本实验中,姜黄素对脂质过氧化的保护作用虽不及槲皮素,但明显强于香草醛.而香草醛对蛋白质的氧化降解和DNA的氧化损伤的保护则优于姜黄素,尤其对蛋白质的氧化降解,香草醛的保护作用甚至强于2种黄酮类化合物.综上所述,4种多酚类化合物对脂质过氧化、蛋白质及DNA的氧化降解有着不同的抑制作用,这一结果会对不同体系中抗氧化剂的使用有指导意义.参考文献:[1]　方允中,郑荣梁.自由基生物学的理论与应用[M].北京:科学出版社,2002.[2]　ZHOU Yan2Chun,Zheng Rong2Liang.Phenolic compoundsand analog as superoxide anion scavengers antioxidant s[J].Biochem pharmacol,1991,42(6):117721178.[3]　CAI Yu2J un,Fang Jian2Guo,Ma Lan2Ping,et al.Inhibitionof free radical2induced peroxidation of rat liver microsomes by resveratrol and analogues[J].Biochim Biophys Acta,2003, 1637(1):31238.[4]　Kwon H Y,Choi S Y,Won M H,et al.Oxidative modifica2tion and inactivation of Cu,Zn2superoxide dismutase by2,2’2 azobis(22amidino propane)dih yd rochloride[J].Biochim Biophys Acta,2000,1543(1):69276.[5]　L IN Xin,Yang 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dation,DNA oxidation induced by f ree radical of four compounds.The result s showed Quercetin,vanillin and rutin are t he most effective in inhibit lipid peroxidation,protein oxidative and DNA damage induced by f ree radical separately.These suggested t hat four compounds appear different activities in different systems.This must take into accountin t he use of compounds t hat antioxidatant s as effective factors.K ey w ords:polyp henol compounds;lipid peroxidation;p rotein oxidation;DNA dam2 age;antio xidation。