本法的细胞得率比自然沉降法高，但明胶增加白 细胞粘性，对实验有所影响。
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第一节 细胞的分离技术
一、标本的采取与保存 表7 人外周血细胞密度一览表
（二）外周血单个核细 胞的分离 （PBMC）
[基本原理] 根据人类各
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——— 细胞 ）
密度（kg/m3
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第一节 细胞的分离技术
二、细胞分离技术
（一）外周血白细胞的分离
根据人外周血红细胞与白细胞的比重不同，其沉降 速度随之而异。
1、自然沉降法 利用RBC自然沉降率较快的分离法。
抗凝血于室温或37℃静置30~60分钟，血液即分成明 显的3层：
上层为淡黄色血浆，
紧贴红细胞上面的灰白层为白细胞
氮罐液面以上一层空间15~20h，然后再移放或沉入液氮中。
2、复苏 复苏解冻必须迅速，力争在20s内使细胞完全融化。
从液氮中取出后迅速移至40℃温水中，融化后要充分洗涤重
悬于新鲜培养液中，使细胞恢复活力。
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第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测
一、T细胞标志及功能的检测 （一）T淋巴细胞受体的检测 1、E受体的检测 （现多用于分离T细胞） 2、白细胞介素-2受体的检测 T细胞激活的特征 （多采用免疫组化学法）
②L-亮氨酸甲基酯法
单核-巨噬细胞内富含溶酶体酶，它能摄取嗜溶酶体的L-亮氨 酸甲基酯，集中于溶酶体上，使该酯转化为对细胞本身有毒 性的L-lencyl亮氨酸甲基酯，但不影响T、B、NK等细胞。用 本法获得的淋巴细胞纯度大于99％，活力＞95％。来自10.08.202010
第一节 细胞的分离技术
一、标本的采取与保存
看视频
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第一节 细胞的分离技术
一、标本的采取与保存 （三）巨噬细胞的采取 1、人巨噬细胞的收集（斑蝥酊敷贴法） 2、小鼠腹腔巨噬细胞的制备
【方法】20-25g小白鼠 （1）小鼠颈椎脱臼处死 （2）腹部消毒，无菌注入肝素-Hanks液 （3）吸出腹腔液，洗涤，计数，调整细胞浓度
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各种血细胞群。
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第一节 细胞的分离技术
一、标本的采取与保存
（三）淋巴细胞及其亚群的分离
1、淋巴细胞的分离
①玻器吸附法 将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的 玻璃平皿内，置37℃ 30 min～40min，用毛细吸管 轻轻吸取悬液，即为淋巴细胞。用适量的Hank’s液 冲洗平皿，收获即为单核细胞悬液。
10.08血.202，0 小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。 4
第一节 细胞的分离技术
一、标本的采取与保存
（二）胸腺细胞悬液的制备 【方法】 4周龄健康小鼠，体重14~16g。 （1）小鼠颈椎脱臼处死。 （2）迅速取出胸腺。置于100目钢网上。注意无
菌，洗干净胸腺上的血管。 （3）轻轻研磨，制成细胞悬液。 （4）用台盼蓝染色，计数。活细胞数＞90%。
细胞免疫学技术
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细胞免疫学技术种类
细胞免疫学技术主要是对各种免疫细胞进行 分离、鉴定、计数，并测定其功能。
➢细胞分离技术 ➢免疫细胞表面标志和功能的检测
T细胞表面标志和功能的检测 B细胞表面标志和功能的检测 NK细胞活性的检测 吞噬细胞检测技术
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第一节 免疫细胞的分离技术
2、肝素抗凝法 肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而 抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，防止血液凝固。
3、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝法 EDTA为螯合剂，可与血 液中钙离子结合而抗凝。
马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔 静脉或耳静脉采血，家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏 或耳静脉采血，犬由颈静脉或四肢静脉采血，豚鼠由心脏采
一、标本的采取与保存 二、细胞分离技术 三、分离标本的保存技术
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第一节 细胞的分离技术
一、标本的采取与保存
（一）血液标本的采取 无菌采血，抗凝 1、机械去纤维蛋白法（玻璃珠法）采血过程中，边采边摇
采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋 白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但本法简便、对淋巴 细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。
底层为红细胞
本法所得的白细胞损伤极轻微。
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第一节 细胞的分离技术
一、标本的采取与保存
（一）外周血白细胞的分离
2、加速红细胞沉降法
利用高分子量的聚合物（明胶）使红细胞凝聚成
串钱状，借以加速红细胞沉降，使之快速与白细胞 分离。
上层富含白细胞
红细胞凝聚成串钱状沉积在底层，
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抗CD3磁球
加入B和T 细胞中
磁球结合T 细胞
磁架进行分离
免疫磁性微 球的分离原
理
正向选择 负向选择
单克隆抗体CD3
直接法对细胞进行分类
羊抗鼠修 饰磁球
Biomag
TT细细胞胞
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间接法对T细胞进行分离 12
第一节 细胞的分离技术
三、分离标本的保存技术
液氮深低温（－196℃）保存技术
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种血细胞的比重有所不 同，利用一种比重介于
——— 红细胞 粒
＞1.092
细
胞
1.075~1.092之间而接 近等渗的分层液作密度 梯度离心，使一定比重 的细胞群按相应密度梯 度分布，从而得以分离
1.070~1.090 淋巴细胞和单核细胞
1.060~1.075
血
小
板
1.030~1.035
（三）淋巴细胞及其亚群的分离 2、淋巴细胞亚群的分离 根据表面的标志不同，建立能选择性纯化所需细胞
的技术。 ①E花环试验 分离T细胞群 ②尼龙毛分离方法 分离T、B细胞 ③亲和层析原理分离淋巴细胞亚群 去除某一细胞群 ④荧光激活细胞分离仪（FACS） 最佳分离方法 磁性微球用于细胞的分离和纯化（MACS技术 ）
但降温过程由于冰晶的形成和渗透压的改变，可导致细
胞的损伤和部分死亡。因此在冷冻过程要加冷冻保存剂，常
用二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。
1、冷冻保存
将待冻细胞悬液加冷冻保存剂，并配成适当浓度，分装
小管。采用两步降温法，即及时迅速地将其降温至一选择好
的临界低温作为过渡站，如一80℃低温冰箱过夜，或放在液