选修3《现代生物科技专题》第一章基因工程基因工程的概念是狭义的遗传工程，其核心是构建重组的DNA分子，早期也称为重组DNA技术。

（一）基因工程的基本工具1.限制性核酸内切酶（限制酶）(1)来源：从细菌中分离出来。

(2)作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

(3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。

2. DNA连接酶(1)两种DNA连接酶（E·coli DNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。

②区别：E·coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。

(2)与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。

DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

3.载体（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。

②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。

③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

（2）最常用的载体是——质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。

（3）其它载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒基因工程的原理：让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细胞中稳定和高效地表达(二)基因工程的基本操作程序(1)获得目的基因有两种方法：①目的基因的序列是已知的：用化学方法合成目的基因，用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增目的基因②目的基因的序列是未知的：从基因文库中提取目的基因。

(2)形成重组DNA分子用一定的限制性核酸内切酶切割质粒，使其出现一个切口，露出粘性末端。

用相同的限制性核酸内切酶切割目的基因，使其产生相同的粘性末端。

将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。

(3)将重组DNA分子导入受体细胞基因工程中常用的受体细胞有：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞。

导入过程：用氯化钙处理大肠杆菌，增加大肠杆菌细胞壁的通透性，使重组质粒进入大肠杆菌受体细胞(4)筛选含有目的基因的受体细胞根据重组质粒上的抗生素抗性基因的抗性或荧光物质筛选出含有目的基因的受体细胞。

筛选含有目的基因的受体细胞的主要方法有：筛选的依据是重组质粒上的标记基因。

即根据重组质粒上的抗性基因，在培养基中加入相应的抗生素，具有抗性的受体细胞能正常生长，说明已成功导入了目的基因。

未导入重组质粒的细胞因无抗性而不能正常生长(死亡)。

也可以根据重组质粒上的荧光基因所表达的荧光物质来确定重组质粒是否成功导入受体细胞。

(5)目的基因的表达目的基因在宿主细胞中表达，产生人们需要的物质。

（三）基因工程的应用1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。

(1)运用基因工程培育动植物新品种最突出的优点是：①能克服远缘杂交不亲和的障碍；②育种时间短。

(2)基因工程在植物育种方面的应用主要表现在：①培育高产、优质的农作物新品种；②培育有各种抗性的农作物新品种。

(3)成果：抗植物病毒的转基因烟草、番茄、苜蓿和马铃薯，抗虫棉，耐贮存的转基因番茄，抗逆性强的转基因农作物等。

2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。

3.基因治疗：向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗的目的。

5．基因工程与生态环境保护利用基因工程技术开发具有生物可降解的新型塑料(聚羟基烷酯塑料)，替代不可降解的化学合成塑料。

利用基因工程技术培育能分解石油中多种成分的“超级菌”。

用转基因微生物处理工业废水等。

第二章克隆技术（一）植物的克隆1．理论基础（原理）：细胞全能性植物体的每个生活细胞都具有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因。

全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞植物细胞全能性表达的条件：离体状态（必要），无菌；有一定的营养物质；植物生长调节剂；一定的外界环境条件（温度,PH,光照）2．植物克隆的技术基础：植物组织培养技术（1）过程：器官发生和形态建成主要是通过平衡的植物激素配比进行调控。

适量的激动素和细胞分裂素配比，可以诱导芽的分化。

适量的吲哚乙酸及适当减除其他激素，则可以诱导生根。

（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。

（3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。

3．植物体细胞杂交技术（1）过程：（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。

化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。

细胞融合的基础：细胞膜的流动性（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。

4．植物细胞工程:培养植物细胞（包括原生质体），借助基因工程方法，将外源遗传物质导入受体细胞（包括原生质体受体）中，或通过细胞融合，显微注射等将不同来源的遗传物质重新组合，再通过对这些转基因细胞或重组细胞进行培养，获得具有特定性状的新植株（二）动物的克隆动物克隆的技术基础：动物的细胞培养和组织培养动物细胞培养的理论基础（原理）：细胞增殖1．动物细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，经过机械消化或胰蛋白酶消化，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。

（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。

（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。

细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

（4）动物细胞培养需要满足以下条件①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。

通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。

此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。

②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。

通常需加入血清、血浆等天然成分。

③适宜的温度和pH④气体环境：O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。

（6）概念：1.原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。

培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代培养。

2.传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。

3.细胞系：可连续传代的细胞连续细胞系：原代培养物在首次传代时就成为细胞系，能连续培养下去的细胞系原因：发生转化，大多数具有异倍体核型如：恶性细胞系（具有异体致瘤性）获得不死性（保留接触抑制，不致癌）有限细胞系：原代培养物在首次传代时就成为细胞系，不能连续培养下去的细胞系4.细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞细胞株的特点：具有恒定的染色体组型、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等连续细胞株：可连续多次传代有限细胞株：可连续次数有限细胞系泛指可传代的细胞，细胞株是具有特殊性质的细胞系。

5.克隆培养法（细胞克隆）：把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个细胞群体的技术。

细胞克隆的最基本要求：克隆来源于单个细胞克隆对象的选择：选择对培养环境具有较大适应范围和具有较强独立生存能力的细胞。

单细胞不如群体细胞，原代培养细胞和有限细胞系不如无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞提高细胞克隆形成率的措施：选择适宜的培养基、添加血清（胎牛血清最好）、以滋养细胞（如经射线照射本身失去增殖力的小鼠成纤维细胞）支持生长、激素（胰岛素）刺激、使用CO2培养箱调节pH。

细胞克隆的最主要用途之一：分离缺乏特殊基因的突变细胞系2．动物细胞融合（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。

融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。

（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。

（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。

（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：4.单克隆抗体（1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。

从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。

（2）单克隆抗体的制备过程：（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。

（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。

（5）单克隆抗体的作用：①作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。

②用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。

(7)动物细胞全能性的表现程度：1、动物细胞的全能性随动物细胞分化程度的提高而逐渐受到抑制2、动物细胞的细胞核仍具有全能性（细胞核内含有该物种全部的遗传物质）3、低等动物细胞的全能性一般比较容易体现。

4、癌细胞仍能逆转为正常细胞。

无论是分化还是癌变，变化的都是表现型，基因组成的完整性并没有改变。

(8)动物难以克隆的根本原因：动物的体细胞已发生分化，细胞分化使得细胞发生了基因的差异性表达，有的基因开放，有的基因关闭。

体细胞基因组中的基因活动很不完全，不能像受精卵那样发挥细胞的全能性。

2.动物体细胞核移植技术和克隆动物（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。

（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。

（3）体细胞核移植的大致过程是：核移植胚胎移植（4）体细胞核移植技术的应用：①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；②保护濒危物种，增大存活数量；③生产珍贵的医用蛋白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植等。

（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。

（6）体细胞克隆羊的培育成功证明了：1、高度分化细胞经一定技术处理，也可回复到类似受精卵时期的功能。