三、将目的基因导入受体细胞
常用的受体细胞： 有大肠杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动 植物细胞等。 转化： 受体细胞 内，并且在 目的基因进入_________ 稳定 和_____ 表达 的过程。 受体细胞内维持_____
转化方法
1.将目的基因导入植物细胞
• 农杆菌转化法 • 基因枪法 • 花粉管通道法
（二）利用PCR技术扩增目的基因
阅读教材P10-P11，回答以下问题： 多聚酶链式反应 ，是一项 1.概念：PCR全称为_______________ 生物体外复制特定 DNA片段 的核酸合成技术。 在________ ___________ 2.结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 DNA双链复制 3.原理：___________ 已知基因的核苷酸序列 4.前提：_______________________ ； 模板DNA 、___________ DNA引物 5.材料：___________ 、 热稳定 DNA聚合酶 、四种脱氧核苷酸 _______________ ______________。 指数 形式扩增，即____ 6.方式：以_____ 2n （n为扩增循 环的次数）
（三）化学方法人工合成目的基因
根据已知蛋白质 蛋白质的氨基酸序列 的氨基酸序列，推测 推测 出相应的mRNA序列， 然后按照碱基互补配 mRNA的核苷酸序列 对原则，推测出它的 推测 结构基因的核苷酸序 列，再通过化学方法， 结构基因的核苷酸序列 化学合成 合成目的基因。 目的基因
人工合成 (基因比较小)
55℃
Taq
72℃
Taq
PCR的基本原理
第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次， 理论上至少需要几个引物？
（24-1）×2=30
2×（2n-1）(n为循环次数)
PCR总结： PCR的基本反应步骤
变性
90-95˚C
延伸 70-75˚C
（2）基因枪法
适用于单子叶植物
基因枪法又称微 弹轰击法，是利用压 缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表 面的表达载体DNA打 入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表 达的方法。
（3）花粉管通道法
植物花粉在柱头 上萌发后，花粉管要 穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在 植物受粉后，花粉形 成的花粉管还未愈合 前，剪去柱头，然后， 滴加DNA（含目的基 因），使目的基因借 助花粉管通道进入受 体细胞。
DNA合成仪
（核心） 二、基因表达载体的构建
1.基因表达载体的目的 （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在 并可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成：
a.目的基因
b.启动子 c.终止子 d.标记基因
它们有什么作用？
注意
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基 因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载 体基础上增加了目的基因、启动子、终止子 三部分结构。 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又 用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种 酶作用的化学键都是磷酸二酯键。 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表 达载体的方式携带进去。
退火
55-60˚C
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制 相 原料 四种脱氧核苷酸 同 条件 模板：DNA双链、 点 酶：DNA聚合酶 解旋 DNA在高温下 解旋酶催化 变性解旋 不 方式 同 场所 细胞内 体外复制 点 酶 热稳定的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶 结果 大量的DNA片段或基因 形成整个DNA分子
归纳: 基因工程的基本操作程序
1. 获取目的基因 从基因 利用PCR 化学方法人工合成
2. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
感受态细胞（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显 微注射法（动物）
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：是否表现出相应性状
过程：变性、退火、延伸三步曲
变性：加热至90～ 95℃双链DNA解链成 为单链DNA 退火：冷却至55～ 60℃部分引物与模 板的单链相应互补 序列结合 延伸：加热至70～ 75℃以目的基因为 模板，合成互补的 新DNA链 变性 延伸
退火
PCR反应
高温变性 低温退火 适温延伸
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
基因表达的计算
转录 DNA mRNA 翻译
蛋白质
氨基酸数
碱基数
6
3
1
• 在真核生物中，对应的是 基因中外显子 的 碱基数基因组和部分基因的比较类型
大小 基因中启动子 基因中内含子cDNA小 无 无基因组
大 有 有
基因多少
物种间基因交流
某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
——检查是否成功
①检测转基因生物的DNA 上是否插入
了目的基因
检测
②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质
鉴定
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
（一）检测
1.检测转基因生物染色体的DNA上是否插入 了目的基因 （1）方法: DNA分子杂交 （2）过程: ① 首先取出转基因生物的基因组DNA； ② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等 作标记,以此做探针； ③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示 出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。
可以
部分因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色体上的位置； 基因的转录产物mRNA；的全部基因。
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
过程： Ca2+处理大 肠杆菌 感受态 细胞 表达载体 与感受态 细胞混合
感受态 细胞吸 收DNA
受体生物 受体细胞
植物
受精卵 体细胞
动物
受精卵
微生物
细胞/个体 用Ca2+处理成 感受态细胞
导入方法
农杆菌转化法 基因枪法
花粉管通道法
显微注 射技术
四、目的基因的检测与鉴定
非编码区 编码区上游 启动子
原 核 细 胞 的 基 因 结 构
编码区
非编码区 编码区下游 终止子
编 码 区 非 编 码 区
能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质
①不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。 ②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。
目的基因： 主要指的是编码蛋白质的基因，也可以 是一些具有调增目的基因； （3）通过DNA合成仪？ 将含有某种生物不同基因的许多 DNA片断，导入到受体菌的群体中， 各个受体内含子 转录、加工修饰
mRNA
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
真核细胞 编码区是间隔的、 不连续 _____的 编码区 和具 都由能够编码蛋白质的_____ 非编码 区组成的 有调控作用的______ 原核细胞 编码区是 连续 的 _____
不同点 相同点
思 考
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核 细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，
与目的基因互补的核酸序列。
2.检测目的基因是否转录出了mRNA ①方法: 分子杂交 ②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,
若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法: 抗原-抗体杂交 （二）鉴定（个体生物学水平） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
（1）农杆菌转化法
①特点：
易感染双子叶植物和裸 子植物，对大多数单子叶植 物没有感染能力 ②原理：
Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞， 并整合到受体细胞染色体的DNA上。
③转化过程:
表 植 农 插入 植物细胞 表达 新 Ti质粒 构建 达 转入 导入 物 杆 性 染色 DNA 载 细 菌 状 目的基因 体 胞
引物1
引物2
PCR的基本原理
Taq酶
• PCR反应条件 • PCR过程 72℃ • PCR的特点
引物1
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 • PCR过程 72℃ • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
重复1-3步 25-30轮
温 度 72 （℃） 55
94
形 成
条变 单性 链
DNA单链 与引物结合
子链延伸 DNA加倍
目的DNA片段 扩增100万倍以上
22 DNA双螺旋
DNA 2
123时间（mn）4595℃
模板DNA
PCR的基本原理
DNA引物
• PCR反应条件 • PCR过区 编码区上游 启动子 编码区 非编码区 编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结 合位点，并与其结合。 转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动， 并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。 转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着 RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。
适用于被子植物
柱头
花药
雌 蕊
雄 蕊
花柱
花丝 胚珠
子房壁
子房
2.将目的基因导入动物细胞 （1）方法：显微注射法（将基因表达载体 提纯，用显微仪注射到受精卵中）
（2）操作程序:
提纯含目的基因表达载体
显微注射
受精卵 移植到子宫
受精卵发育