基于磁珠的大规 ABI 模并行连接测序
Helicos Ion Torrent
SMRT
单分子荧光测序 Helicos 半导体测序 Life-technology
单分子实时测序 Pacific Bio
目前成熟的三大高通量测序技术简介 Next Generation Sequencing
• • • • Sample fragmentation Library preparation Sequencing reaction Data analysis
（a）高通量鸟枪Sanger测序法。首先基因 组DNA被随机切割成小片段分子，接着众 多小片段DNA被克隆入质粒载体，随后转 化到大肠杆菌中。最后培养大肠杆菌提取 质粒，进行测序。每一个测序反应都在只 有几微升的反应体系中完成。测序后获得 一系列长短不一的末端标记有荧光的片段， 最后通过对每一个延伸反应产物末端荧光 颜色进行识别来读取DNA序列。 （b）鸟枪循环芯片测序法。首先将基因组 DNA随机分割成小片段DNA分子，然后在 这些小片段DNA分子的末端连接上普通的 接头，最后用这些小片段DNA分子制成 polony芯片。每一个polony中都含有一个小 片段DNA分子的许多个拷贝。许多这样的 polony集合在一起就形成了polony芯片。这 样一次测序反应就可以同时对众多的 polony进行测序。然后与sanger法中一样， 通过对每一个延伸反应产物末端荧光颜色 进行识别来读取出DNA序列。重复上述步 骤就能获得完整的序列。
Sequence ~1000 molecules per ~ 1 µ m cluster ~1000 clusters per 100 µ m square ~40 million clusters per experiment
20 microns
Sequencing-by-Synthesis (SBS)
焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是由Nyren等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级 联测序技术。红色单链表示模板链，引物以黑色表示，DNA聚合酶以绿色的椭圆形表示。每 当掺入一个碱基（如图中蓝色的G）时，就会释放出焦磷酸（PPi），然后被磷酸化酶 （sulfurylase，图中蓝色箭头所示）转化成ATP。然后荧光素酶（图中红色箭头所示）就可 以在ATP参与下将荧光素转变成氧化荧光素，同时发光也会被测序仪检测到。测序反应是通 过释放PPi经过ATP硫酸化酶和荧光素酶作用发光，向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好 能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3‘末端， 同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi），CCD捕捉拍照。反应是连续的，所以遇到连续的碱 基如polyA时，易产生误差。
Nature (2001) 409:860-921
分层的shotgun测序法
刺激DNA测序技术发展的四个方面
人类基因组计划的出现，使人们面临了巨大的经费问题，因为传统的 Sanger 测序法无论如何优化，也无法大幅度降低测序费用； 人类以及其它主要模式生物参考序列数据库的建立使得短片段作图成为可 能，这极大地促进了短片段测序技术的发展；
454 sequencing： Emulsion PCR (emPCR)
A
+ PCR Reagents + Emulsion Oil
B
Adapter carrying library DNA
Micro-reactors
Mix DNA Library & capture beads (limited dilution)
9
高通量测序技术的起源与发展
• • • • • • • • 1992年Lynx Therapeutics MPSS 2003年Polony Sequencing（哈佛） 2005年454 Pyrosequencing 2006年Solexa Sequencing-by-Synthesis 2007年ABI SOLiD 2008年Helicos tSMS Sequencing 2010年Ion torrent Semiconductor Sequensing 2011年Pacific Biosciences SMRT Sequensing
2 高通量测序原理简介以及比较
高通量测序简介
• 高通量测序:一次性对几百万到十亿条DNA 分子进行并行测序，又称为下一代测序技 术，其使得可对一个物种的转录组和基因 组进行深入、细致、Sequencing • Next Generation Sequencing • Deep Sequencing
Roche 454 焦磷酸测序 Pyrophosphate Sequencing
Illumina Solexa 合成测序 Sequence by Synthesize
ABI SOLiD 连接法测序 Sequence by Ligation
传统的Sanger测序法及新 一代DNA测序技术工作流 程图比较：
探针连接，检测荧光
切除荧光基团
第二轮探针连接，检测荧光
切除荧光基团 每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基，因此一条测序引物读取的序列是不完整的
连接法测序 （二）
测序引物沿着Adapter移动5次，确保每个位点都被检测
SOLiD 的特点与主要应用
• • • • 读长较短，50-75bp 精度高，可达Q40 通量高， 20-30G每天，1Run 可达120G 主要应用：基因组重测序、SNP检测等
Walter Gilbert（1932~）
Sanger测序技术
PCR末端终止技术+电泳检测技术 单个片段序列测定 最高通量：小于4MB/天
基于平板胶的测序技术
96通道毛细管阵列
人类基因组从头测序分析
HGP项目：20世纪90年代美国能源部 资助启动人类基因组计划，六个国家 的科学家耗资4.37亿，于2000年完成 人类基因组工作草图。 方法和结果：应用分层shotgun+Sanger 测序法，结果预测了31,000个基因， 证明基因组的95%是非编码序列。 意义：人类基因组测序的完成标志着 分子医学时代的到来；此项目也催生 了高通量测序技术。
Illumina Solexa 测序流程
Solexa 的特点与主要应用
• 读长较短，100－150bp • 通量高，25G每天，120-150G每Run • 主要应用：RNA测序、表观遗传学研究
ABI SOLiD 简介
• SOLiD Sequencing by Oligo Ligation/Detection • Oligo连接测序：通过连接酶连接，再对 oligo上荧光基团进行检测
3’ 5’
Cycle 1: Add sequencing reagents First base incorporated Remove unincorporated bases
A T G C G C A G A T G C T T A C G A T A C C C G A
Detect signal Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat
Illumina Solexa简介
• 桥式PCR • 边合成边测序 • 可逆终止物
HiSeq 2000
Clonal Single Molecule Arrays 单分子克隆 Attach single molecules to surface
Amplify to form clusters Prepare DNA fragments Ligate adapters
C T
1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以 被去除的阻断基团
2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号 3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序 反应
T C
G A T
5’
Reversible Terminator Chemistry 可逆终止反应
不断涌现的新型分子生物学技术极大地促进了分子生物学的发展，随之而 来的越来越多的比如基因变异、RNA 表达、蛋白与DNA 相互作用以及染色 体构象等等生物学现象需要人们用高通量DNA 测序手段去解释，这也极大 地促进了新型测序技术的发展；
其它学科、各项相关技术的发展，例如显微镜技术、表面化学技术、核苷 生化技术、聚合酶工程技术、计算机技术、数据储存及分析技术等，为 DNA 测序技术提供了极大的支持。
一般高通量测序技术流程Shot Gun构建 DNA片段固定 单条模板扩增
序列组装和比较
1
图像获得和处理
TGCT…
簇序列读取反应
2
3
TTTT…
4
454 Pyrosequencing
• 基于磁珠的焦磷酸测序：
A 磁珠制备设备
C 454测序原理
B 454测序仪
454新测序方法用到的焦磷酸测序原理
高通量测序技术及其应用
李海阔 博士
上海业力生物科技有限公司
Shanghai Yeli bio-technology Co. Ltd
主要报告内容
1 测序简介
2 高通量测序原理简介以及比较 3 一些应用实例 4 前景展望
1 测序简介
经典的DNA测序技术
Sanger法 化学法
Frederick Sanger（1918~）
Create “Water-in-oil” emulsion
Adapter complement
Enrich Anneal Seq primer “Break micro-reactors” Isolate DNA containing beads Perform emulsion PCR
Generation of millions of clonally amplified templates on each bead No cloning and colony picking