根癌农杆菌介导的真菌转化
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根癌农杆菌介导的真菌转化
(一)农杆菌电击感受态制备及电击转化A感受态的制备
1)将农杆菌菌液划线于Yeb平板（50μg/mlkana），28℃，36-48h。

2)挑单菌落至3mlYeb试管（50μg/mlkana）中，28℃，200rpm培养过夜。

3)转1ml至50mlYeb中，28℃，200rpm培养至oD600=0.8。

4)于4℃，5000rpm，10min收集菌体。

5)用50mL10%的甘油（去离子水配置，湿热灭菌）洗沉淀3次（4℃，5000rpm，10min），洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。

6)重悬于1ml10%甘油中（约1011个细胞/ml），可立即使用，或分装为每管50μl，液氮速冻后，-80℃保存备用。

b电击转化
1)将1μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至无菌预冷的电击杯中。

2)将电击杯放入电转化仪的电极之间，16kv/cm，5ms。

3)取出电击杯，迅速加入200-300μlYeb（不加抗生素），并将混合液转入ep管中。

4)于28℃，220rpm，2-3h。

5)将50-100μl菌液涂布于Yeb平板（50μg/mlcar和50μg/mlkana）上，于28℃培养2-3天后，挑斑鉴定。

(二)农杆菌化学感受态制备及化学法转化petentcells
1)Inoculateasinglecolonyto5mlLb2)growat28℃tologphage,shakingat250rp m
3)Inoculate2mlofthecultureto50mlLbmediumandgrowtooD600=0.5ca.8h ours4)chillonicefor10minutes
5)spindownthecellsbycentrifugationat3000g(8000rpm)for10minutesat4℃
6)Resuspendcellsin1mlof20mmcacl2
7)Aliquotsinto0.1ml,thenfreezeinliquidnitrogen,andstoreat-80℃bplasmid Transformation
1)Thawcompetentcellsonice.
2)Add1μgplasmid(5μl)tothecompetentcellsandmixwell.3)Freezeinliquidni trogenfor5min.4)heatshockat37℃for5min.
5)Add1mlLbandgrowat28℃for3hrwithshakingat150rpm.
6)spreadcellsontoLbplatescontaininganappropriateantibioticandincubate atroom
temperaturefor2-3days.
(三）农杆菌介导的真菌转化
1将已转入目的质粒的农杆菌接种于4mlYeb液体培养基（50μg/mlcar和50μg/mlkana）中，于28℃摇床中220rpm过夜培养（16-20h）。

2将培养液12000rpm,3min，并用ImAs液体重悬菌体至oD660=0.1-0.15，体积约为10-15ml（一般用50ml三角瓶）。

3于28℃摇床220rpm培养6-7h。

4制备真菌孢子悬液，浓度105-106/ml（制备方法参见（四））。

5将上述农杆菌菌液100μl和孢子悬浮液100μl混匀，涂布于ImAs
平板（涂板后要将其风干至未见明显水纹为止），25℃共孵育2天。

6用3-5ml无菌水洗涤共孵育2d后的培养物，将充分混匀的洗涤物200μl涂布于m-100平板（200μg/mlppT和300μg/mlcef）上，适当风干后，放入25℃培养，5-6d后挑选生长比较大的菌落于48cellsDAY 板。

7培养3-4天，再将48cellsDAY板中的菌丝转接到小平板（直径6cm，贴有玻璃纸）上，3d后抽提基因组验证是否转化成功。

(四）孢子悬液的制备（现配现用）
1从培养约14d的pDA平板上刮取适量的孢子粉到1.5ml无菌的0.05%Tween-20中，涡旋分散。

2用脱脂棉过滤除去菌丝，滤液收集于1.5mlep管中，12000rpm，3min收集孢子。

3去上清，用1ml无菌水重悬孢子，12000rpm，2min，再次收集孢子。

4再用适量的无菌水重悬孢子，血球计数板计算孢子数目，并将孢子悬液调到105-106/ml。

(五）相关培养基配方1Yeb培养基
蔗糖0.5%（w/v）细菌用酵母提取物0.1%（w/v）细菌用蛋白胨1%（w/v）mgso4.7h2o0.05%（w/v）
121?c灭菌20min，固体加入1.5%琼脂粉
2培养基母液（stocksolutions）2.12.5×mmsaltsforIm1L
K2hpo43.625gKh2po45.125gmgso4.7h2o1.25gnacl0.375gcacl2.2h2o(w/v
)0.165gFeso4.7h2o(w/v)0.0062g(nh4)2so4(w/v)1.25g
Dissolveeachsaltoneatatime,donotautoclave.storeatroomtemperature.Fi nalsolutiontypicallycontainsasmallamountofwhiteprecipitate.2.2m-100tr aceelementsolution
h3bo330mgmncl2.4h2o70mgZncl2200mgna2moo4.2h2o20mgFecl3.6h2 o50mgcuso4.5h2o200mgddh2oTo500mlfinalvolume
2.3m-100saltsolution
K2hpo416g
na2so44g
Kcl8g
mgso4.7h2o2g
cacl21g
m-100Traceelementsolution8ml
ddh2oTo1Lfinalvolume
3mediaandplates3.11mmes
称9.762gmes，溶于约40mlddh2o中，然后用5mKoh调ph值至5.3，最后定容到50ml，并过滤灭菌。

3.210mmAs
称0.0981gAs，溶于约40mlDmso中，然后用5mKoh调ph值至8，最后定容到50ml，并过滤灭菌。

3.3Inductionmedium(Liquid)
Ingredients1xmmsalts10mmglucose5‰glycerolddh2o
Autoclave.coolto50℃,thenadd:
40mmmes
200μmAs
For200mlmedium
80mlof2.5xmm0.36g1ml
To188mlfinalvolume8mlof1mstock4mlof10mmAs
notethatthereistwiceasmuchglucoseintheliquidinductionmediumthanthe inductionmediumplates.
3.4Inductionmediumplates:
IngredientsFor200mlmedium1xmmsalts80mlof2.5xmm10mmglucose0.1 8g5‰glycerol1mlddh2oTo188mlfinalvolume1.5%Agar3g
Autoclave.coolto50℃,thenadd:
40mmmes8mlof1mstock
200μmAs
4mlof10mmAs
3.5m-100plateswith300μg/mlcefotaximeand200μg/mlppTIngredientsFor 1000mlmediumm-100saltsolution62.5mlglucose10gKno33gddh2oTo100 0mlfinalvolume1.5%Agar15g
Afterautoclavingandcoolingthemediumuntilitisjustwarmtothetouch,add3 ml100mg/mlcefotaximeandappropriatevolumeofppT(dependingonconce ntrationofcommercialstock).
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