澳大利亚蜂蜜中的羟甲基糠醛与淀粉酶含量摘要澳洲蜂蜜样品(加工及未加工)的质量是用来评估HPLC技术。
羟甲基糠醛作为主要的质量指标。
包括四个经过商业加工的蜂蜜样品（澳大利亚雨林,Beechworth、homebrand和Leabrook)和三个未加工的蜂蜜样品(Banksia、灰盒子和Mallee)。
所有样品,除了Leabrook和Beechworth,中的初始羟甲基糠醛(HMF)含量低于法典委员会标准和国际蜂蜜标准(40毫克/公斤)外，其余样品都高出标准。
Leabrook和Beechworth中的羟甲基糠醛分别为50.8±1.34毫克/公斤和74.9 ±234毫克/公斤。
在85°加热未加工的蜂蜜2分钟造成显著(p≤ 0.05)蓄积的羟甲基糠醛含量。
在85°C加热2分钟后Mallee的样品中羟甲基糠醛的量从34.0±0.31增加到42.3±0.37毫克/公斤。
所有的蜂蜜淀粉酶活性样品显示超过最低限度(8 Gothes)。
蜂蜜成品的理化性质的变化有明显的样品。
结果显示,加热也并不是唯一的影响羟甲基糠醛(HMF)在蜂蜜中形成的因素,还有蜂蜜的成分、pH值和植物源可导致这些变化。
因此,一定数量的羟甲基糠醛(HMF)可能不是一个唯一的蜂蜜质量指标。
关键词: 羟甲基糠醛;Gothe单位数,淀粉酶活性;加工过的蜂蜜；新鲜蜂蜜。
1．介绍澳大利亚新西兰食品标准 (FSANZ,2006年)规定了蜂蜜的定义即蜜蜂是从花朵或植物的生命部位所分泌的物质中制造出的自然甜美的物质。
它必须包含至少60%的还原糖和不超过21%的水分。
蜂蜜成分是高度受到蜂蜜所采的花朵的类型、区域和气候条件的影响(门德斯,Proenca、费雷拉、和费雷拉,1998)。
澳大利亚是世界上第四大蜂蜜出口国。
在澳大利亚蜂蜜行业每年至少价值达6500万美元。
新南威尔士是蜂蜜的主要生产者,占总产量的45%。
制造出的蜂蜜有一半是在国内消费的,而剩下的则出口(澳大利亚蜂蜜工业委员会,2004年)。
在澳大利亚桉树代表了生产蜂蜜的主要本土植物(78%)（吉布斯和Muirhead，1998)。
约有95%的桉树构成了安大利亚的植被,统治了森林植被中的约550-600个不同类型的物种和品种,还有许多杂交物种(凯莉,1983)。
加热新鲜蜂蜜通常是为了方便加工和保持良好的质量。
然而过度热处理会形成羟甲基糠醛(HMF)以及降低蜂蜜质量。
羟甲基糠醛的量在新鲜蜂蜜中几乎没有或很低 ,而在加热过的蜂蜜中含量很高,它们储存在不适当的条件,或搀假在逆变糖浆中(Nozal伯纳作了开题报告,Toribio,希门尼斯,马丁,先后,2001)。
蜂蜜的理化性质如酸碱度,矿物含量和总酸度也会影响羟甲基糠醛含量。
在有机酸存在和低水分活动的情况下,也会影响产品中的羟甲基糠醛含量 (Kalabova ,Borkovcova ,Smutna,和Vecerek,2003)。
食品法典(2001)和国际蜂蜜委员会 (2002)设定了最大的羟甲基糠醛浓度：非热带地区为40毫克/公斤、热带地区为80毫克/公斤。
极高的羟甲基糠醛值(> 500毫克/公斤)证明了糖浆的逆变掺假(Novelli椰子、Valentini,及Ceccon,1996)。
食品法典(2001)提出了蜂蜜的两种质量指标,即羟甲基糠醛值、淀粉酶活性来衡量蜂蜜的新鲜程度。
许多国家已经建立了限制蜂蜜中羟甲基糠醛的含量为40毫克/公斤。
在澳大利亚维多利亚市蜂蜜的生产很大程度上依赖于本土植物和各种作物,比如苹果、梨子、樱桃、浆果、对话、奇异果和蔬菜。
特定的植物物种和农作物生产的蜂蜜在颜色和风味上有特定的特点。
蜂蜜可以从植物源的甘露或者通过的那个城镇的名字来分类。
大多数的澳洲天然蜂蜜使用了一个主要来源特定的植物花蜜。
例如,灰盒子蜂蜜是在桉树 (灰色盒子)之后被命名的,这是一种有25米高的中等大小的树。
花蕾出现在12月初，开花是在三月初持续到五月底,也有持续到冬季的(Heathmont Honey.开花,2009年)。
班克西亚椤的淡红桔黄色的花的是地道的蜂蜜颜色。
班克西亚椤是周围170个山龙眼科的物种之一。
它们是澳大利亚标志性的野花和受欢迎的的花园植物,很容易被认可,因为他们独特的锥花刺以及圆锥形的果实，可以从匍匐的灌木到达30米高的树(Banksia Integrifolia.,2009年)。
然而,Mallee蜂蜜是以西北部的一座城市命名的,它是澳大利亚维多利亚州的一条狭窄的灌溉土地带, 种植葡萄、柑橘、小麦等,并且生产奶制品以及养殖羊。
Mallee据说是来自一个桉树的指示性土著物种,因此我们才有了Mallee蜂蜜,这主要取决于作为蜂蜜来源的桉树家族(《大英百科全书》Encyclopedia.,2009年)。
此外,一些商业蜂蜜制品常常来源于混合而成的花，然后被贴上的野花蜂蜜的标签(澳大利亚雨林)或花园蜂蜜(Beechworth和Leabrook) ,或混合提取后的蜂蜜(Homebrand)。
尽管有很多国际科学组织调查了蜂蜜中的酶以及其物理化学性质,但是关于澳大利亚蜂蜜标准的质量检测方法依旧缺乏。
另外, 由于廉价的果糖玉米糖浆的大量生产，纯蜂蜜掺假和合成蜂蜜的现象近年来已更普遍,更难被发现的,。
因此,这个项目的开发有助于彻底检查澳洲蜂蜜和确认一个与法典标准相比的羟甲基糠醛(HMF)含量的理化性能。
2材料和方法2.1实验设计新鲜的未加工的蜂蜜样本,来自于在东北的维多利亚(Mallee)的第一产业部门(新闻部),包括Mallee和灰色盒子,Banksia蜂蜜。
每一个新鲜的未加工的蜂蜜样品重500克,并且是2006年那一季的。
2006年7月澳大利亚商业加工过的蜂蜜样品(每份500克)被购买于墨尔本的当地超市,包括澳大利亚雨林,Banksia Leabrook和Beechworth,。
原始容器中的样品在室温下被保存在一个黑暗的房间 ,整个分析于2006年11月中旬完成。
每个蜂蜜样品被分成了三个地区农业机械化的发展代表, 并重复3次。
所有的分析处理至少3次。
2.2蜂蜜样品的热处理取蜂蜜样品5克于猎鹰管 (BD生物科学、富兰克林湖泊、台北) 中, 分别置于65°C, 77°C和85°C的水槽(Thermoline，澳大利亚)中保持2分钟后，在冰水浴中冷却4分钟。
经过热处理的样品用于分析其淀粉酶活性以及羟甲基糠醛(HMF)值。
2.3材料羟甲基糠醛(HMF) 的分析标准,来自西格玛奥德里奇(Steinheim、德国)的。
分析级别的硫酸，来自Univar公司(新南威尔士、Sevenhills Univar澳大利亚)。
甲醇的高效液相色谱级，来源于默克公司(Kilsyth,维克,澳大利亚)。
水是采用Milli-Q水系统洁净的，来源于Millipore(MA)贝德福德的新家。
所有其他化学物质被购买从当地的化学品储存在校园里。
2.4蜂蜜的含水量、pH、游离酸度,内酯和总酸度的测定直接烘干法是确定含水率的一个标准方法。
在该方法中,取2.5 g的蜂蜜样品置于铝盘中,混合着2克的分析级别的酸洗砂，在105°C烤箱里干燥,使用该方法的是国际蜂蜜委员会(2002)。
pH值的测定是将10克蜂蜜置于含有75ml二氧化碳自由水溶液的250ml烧杯中 (PHM 210标准的pH仪、研究生实验室、辐射计、哥本哈根)。
游离酸度和总酸度是用滴定法(国际蜂蜜委员会,2002)来测定,并且按下面方程计算:游离酸度=(消耗的0.05mol/L的NaOH溶液的毫升数—空白样品的毫升数)×50(样品克数)内酯=（10.00—消耗的0.05mol/L的HCl溶液的毫升数）×50(样品克数)总酸度=游离酸度＋内酯2.5颜色的测量颜色是用美能达颜色测量仪 (东京,日本)来测定,通过一种具体表现形式以避免蜂蜜样品的变质。
将蜂蜜样品(15克)倒进一个一次性小培养皿(55毫米×14毫米)中,盖上盖子,在室温下放置20分钟,然后用颜色测量仪测量(Ajlouni,2006)。
在上述三种不同的温度下测出读数,并且计算平均值。
2.6淀粉酶活性的评价将热处理后的蜂蜜(5克) 溶解在含有15毫升Milli-Q水和5毫升醋酸的缓冲溶液(pH 5.3)中,并转移到一个含有3毫升氯化钠溶液的50ml容量瓶中并稀释至刻度。
用立方体加样器取10毫升蜂蜜和10毫升1%的淀粉溶液分别置于两个50ml烧瓶中,然后放置在40°C水浴中。
15分钟后,取5毫升淀粉溶液加入蜂蜜中,混合并定时。
在一个周期内,在第一个五分钟后,取0.5毫升的混合物并将其与5毫升稀释碘溶液和22毫升Milli-Q水混合,以水为空白样在波长660nm处测定吸光度。
在吸收率为0.235时，用吸光率与时间的关系图确定时间。
淀粉酶数量的计算按照国际蜂蜜委员会中提到的方法(2002)。
2.7双糖,葡萄糖和果糖的含量的测定糖成分主要由一个配有示差折光检测器(HPLC-RI )的高效液相色谱 (Shimadzu,日本东京)在30°C时测定。
将1克蜂蜜样品溶解在19毫升的Milli-Q水中,并用0.22μm的尼龙过滤至一个高效液相色谱小瓶,盖好盖子后用针筒取20μl注射进高效液相色谱柱中。
色谱柱为C-610H ，30cm×7.8mm，配有一个C-610H ,4.6 mm×5cmI.D.col:H + 11,855的备用柱。
流动相是流量为0.75毫升/分钟的0.005 M的硫酸。
外部标准溶液的校准曲线是用来建造量化样品(国际蜂蜜委员会,2002年)中糖含量的。
结果表现为每100克蜂蜜中含有1g糖。
2.8 HMF的定量将蜂蜜样品（5克）溶于约25毫升Milli - Q水并转移至50毫升容量瓶中。
为了澄清蜂蜜样品，并阻止羟甲基糠醛分解，将0.5ml 15％亚铁氰化钾溶液和0.5ml的30％脱水乙酸锌溶液加入上述溶液中并用Milli - Q水定容到50毫升。
通过瓦特曼滤纸过滤后，丢弃前10毫升的滤液。
在高效液相色谱分析前，将滤液通过0.22μm微孔滤膜过滤（国际蜂蜜委员会，2002年）。
高效液相色谱柱是由一个SCL- 10A的系统控制器，一个LC - 10AT的液相色谱仪，一个FCV- 10AL的泵，一个DGU - 14A的脱气装置和来自南港岛津（东京，日本）的SIL 10AD自动注射器组成。
高效液相色谱柱用的是型号为Supelcosil LC - 18，反相是不锈钢柱（(Supelco,Bellefonte, PA）（25厘米× 4.6 mm内径;薄膜厚度5微米），并连同型号为C18的保护柱在30 ° C时操作。