液氮超低温冻结保藏技术规范
1. 目的
规范液氮超低温冻结方法保存各类微生物菌种的操作，保证菌种长期保藏的质量和安全。

2. 范围
本规程适用于各类微生物菌种的液氮超低温冻结保存。

3. 基本原则和要求
针对接收的不同类群的微生物菌种资源，保藏中心应根据工作经验和微生物菌种提供人的建议，选择合适的冻结速度和保护剂系统，进行微生物菌种的液氮超低温冻结保存，以保证这些微生物菌种在长期保藏过程中的活性和稳定性。

4. 规程
4.1 准备冻存管
4.1.1 用蒸馏水浸泡、冲洗干净耐低温（聚丙烯）塑料冻存管，干燥后备用。

4.1.2 保藏中心应为保存菌种的每一支冻存管标注明确的标识，标签内容应至少包括菌种的保藏编号和制备批号（日期），可将保藏编号排在第一行，制备批号用连续的年月日（八位数字）表示，排在第二行，并根据冻存管的容积将标签裁成合适的大小。

保藏中心应根据标签的放置位置选择符合要求的标签材质，以确保在长期的保藏过程中，标签不会发生自然或人为的脱落、污损。

4.1.2 将准备好的标签放置于冻存管规定的位置，加入或不加入合适体积的保护剂，拧上冻存管帽，装入塑料冻存盒中，1 公斤压力蒸汽灭菌30 分钟，备用。

4.2 准备保护剂
根据需要保藏的微生物类别选择适宜的保护剂种类，按照配方配制、分装、灭菌备用。

用于保存厌氧微生物的保护剂，应除去保护剂中的溶解氧。

4.3 菌种保藏
4.3.1 无菌操作将符合质量要求的、需要保藏的菌种接种在规定的培养基上，并尽量涂满整个斜面，置最适宜的条件下培养，单细胞微生物菌种培养至对数生长期后期（静止期初期），对于放线菌和产孢丝状真菌应培养至形成成熟的孢子。

对于生物量较低的菌种，应多准备几只斜面菌种。

对于不产孢子的丝状真菌，无菌操作将需要保藏的菌种接种在规定的平板培养基上，培养时间根据菌种的生长速度确定。

4.3.2 用无菌滴管将一定体积的灭菌保护剂无菌操作注入培养好的斜面菌种试管中，并将菌苔（或孢子）轻轻刮下，吹打数次，制成细胞或孢子悬浮液。

需要液体培养的菌种，离心收集菌体后，制备菌悬液。

4.3.3 核对菌种试管上标注的菌种编号与事先准备好的冻存管标签上标注的菌种编号的一致性。

用无菌滴管将菌悬液分装进冻存管中，拧紧管帽，放入冻存盒中。

4.3.4 对于不产孢子的丝状真菌，用无菌麦管或打孔器将培养好的菌种打成直径约5mm 大小的菌片（也可用无菌解剖刀将培养好的菌种切割成小菌片），用接种针将切割好的菌片分装入准备好的冻存管中（沿菌落半径挑取菌片，每管3-5 片），拧紧管盖。

4.3.5 将装有冻存管的冻存盒放入专门的提篮架中，直接（或经过慢速/梯度降温处理后）放置进指定的液氮生物储罐（液氮冰箱）中，并记录存放位置。

4.4 质量检测
对于保藏的微生物菌种，尤其是新类型的微生物，可在保存24 小时以后，随机取出一只冻存管，按照规定程序，进行恢复培养，检查保藏菌种的存活性、存活率和纯度，记录检查结果。

保藏5 年后，可再随机取出一只冻存管检测存活及存活率，记录检查结果。

4.5 保藏菌种的恢复培养
4.5.1 根据微生物菌种的类别，准备不同温度的水浴，解冻融化保藏的菌种。

细菌、古菌，38℃水浴；真菌（包括酵母菌）：30 水浴℃；对高温敏感的真菌（如Oomycota）选择25℃水浴。

4.5.2 从液氮冰箱中取出菌种时应注意安全防护。

取出菌种之前，应带好防护手套避免人体皮肤触及液氮或超低温箱体；面部应带好防护面罩，以防安瓿管取出后，可能发生的安瓿管内液氮极速气化导致的安瓿管爆炸伤及面部。

4.5.3 从液氮冰箱中取出菌种冻存管后，应立刻放入准备好的水浴中，轻轻摇动，使冻结安瓿管在最短的时间内快速、完全融化。

4.5.4 用70%乙醇脱脂棉球消毒安瓿管外壁。

开启安瓿管，用无菌吸管吸取全部菌悬液（或用接种针移植安瓿管中的菌块），移植于适当的培养基试管（或培养皿）中，在规定的条件下培养。

污染等。