大家好
临床分子生物学检验
第九章
细菌感染的分子生物学检验
湖南省中医药大学生化与分子生物学教研室 Jake Li
细菌感染是致病菌或条件致病菌入侵机体，并在机体 中生长繁殖，产生毒素或其他代谢产物所引起的全身 性感染，临床上以寒战、高热、关节疼痛等为特征， 部分患者还可以出现烦躁、四肢厥冷、发绀、呼吸加 速、血压下降、感染性休克等临床症状。
TB具有合成所有必需氨基酸、维生素和酶辅助因 子的潜在能力。该菌具有代谢各种各样碳水化合 物、乙醇、酮和羧酸的能力。此外，还具有许多 涉及脂代谢、糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸和 乙醛酸循环所必须的酶分子。
TB的培养特点：馋、懒、丑。 馋--营养要求较高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、 甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基（罗氏） 上才能生长良好。 懒--生长缓慢，14～18h分裂1次，在固体培养基 上2～5w才出现肉眼可见的菌落。 丑--典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透 明，乳白色或淡黄色，如菜花样。
一、细菌感染的一般性检出策略
细菌感染性的分子生物学检验的一般性检出就是以感 染病原体的特异核酸序列作为检测目标序列，利用分 子生物学技术对目标序列进行检测，从而直接判断有 无细菌感染和是何种病原体感染。
二、细菌感染的完整性检出策略
完整性检出策略，即不仅对病原体作出快速准确诊断， 还需要对其进行分型（包括亚型）和耐药性等方面的 检测，尽可能地为临床诊疗提供更为详尽的细菌病原 体的相关信息。
二、结核分枝杆菌的分子生物学检验内容
（一）结核分枝杆菌核酸的检测
可采用PCR、real-time PCR、PCR-RFLP、线性探针杂 交、链替代扩增技术、扩增结核分枝杆菌直接试验、基 因芯片技术、全自动结核检测平台等方法检测标本中的 TB DNA。 1、 PCR PCR扩增所选靶序列主要有65kD抗原基因、 MPB蛋白基因、rRNA基因、TB IS6110插入序列、染色 体DNA的重复序列等。常规PCR的不足：产物的交叉污 染、假阳性、假阴性、实验室污染。 2、real-time PCR 与传统PCR相比，具有敏感度、特 异性高及方便快速等优点，特别是对难以培养与生长缓 慢的结核杆菌的检测更有优势。
一、结核分枝杆菌的基因组结构特征
TB H37Rv 全基因组为环状双链 DNA，长约4 411 529bp，共有 4000基因， G+C平均值65.6%， 其基因序列高度保守。 H37Rv 基因组中有50 个编码功能 RNA 的基因，其中 45 个 tRNA基 因，3 个 rRNA 基因和 2 个核稳定 （stable）RNA基因，这些 RNA 分子是由特异的核糖体RNA 操纵 子产生的。
传统上对于细菌感染的病原体检测主要采用免疫学、 微生物学和血液学等相关技术，但这些技术方法受灵 敏度和特异性的限制，不易达到早期诊断。
利用分子生物学技术检验感染性病原体自身遗传物质 （RNA或DNA），从而达到早期、快速、敏感、特异 地检测已经成为临床检验的主流技术之一。
第一节 细菌感染的分子生物学检验策略
第二节 结核分枝杆菌的分子生物学检验
结核分枝杆菌(TB)，简称结核杆菌，是引起结核 病的病原体。随着抗结核药物的不断发展和卫生 生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度 大幅下降。近年，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐 药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困 及人口广泛流动等因素，全球范围内结核病的疫 情死灰复燃。 据WHO统计，全世界约1/3的人感染了结核分枝 杆菌，在某些发展中国家成年人中群中结核分枝 杆菌携带率高达80%，其中的5%~10%携带者可 发展为活动性结核病。
187个ORF参与脂类代谢、细胞壁合成， 360个参与细胞壁代谢， 66个参与脂类合成， 287个参与能量代谢， 95个参与氨基酸合成， 38个与细菌毒力相关， 69个参与DNA合成。
所编码的蛋白约有40%的为功能性蛋白，44%的 与已知蛋白有相似性信息，16%的则为未知蛋白。 TB不同菌株之间存在多个差异基因。 基因组中有3个毒力因子：mce、过氧化氢酶-过 氧化物酶和sigA。除了这些单基因毒力因子，细 菌的胞壁也对致病性起着重要的作用。
在H37Rv 全基因组中有16个拷贝的IS6110插入序列和6个 拷贝的IS1018，大多数插入序列位于基因间或非编码区， 通常靠近tRNA基因聚集成串，插入序列在染色体中主要分 布在重复区。
TB H37Rv 基因组中共有3924个开放阅读框，其 中91%有潜在的编码能力，ORF中最常见的起始 密码子61%为ATG，35%为GTG。
期使用易产生耐药性） 变异性 ※典型形态→耐药
目前结核杆菌常规检测方法
痰涂片法阳性率低，且易受非结核杆菌的污染。 培养法目前认为是诊断的“金标准”但结核杆菌 生长缓慢，不利于临床上的及时诊断和治疗。 血清学试验由于分枝杆菌属各菌之间抗原有着广 泛的交叉，特异性不强。
分子生物学检验是以核酸（DNA或RNA）或蛋 白质分子为检验目标，通过检查人体内源基因 或外源（病原体）基因的存在、缺陷或表达异 常，对人体状态或疾病作出特异性诊断的方法 和过程。
机体感染细菌后，应用分子生物学技术直接测 定这些细菌病原体基因，不仅可以对微生物感 染作出明确诊断，同时也能诊断出带菌者或潜 在性感染，还可以对感染性病原体进行分型和 耐药性监测。
结核分枝杆菌天然地对很多抗生素有抵抗力，使得 治疗极其困难。该菌的药物抵抗力主要由于其具有 高度疏水的细胞壁充当渗透屏障。同时，在基因组 中还发现有许多药物抗性决定因子的编码序列，包 括水解酶或者药物修饰酶，例如乙酰转移酶和很多 药物外排泵系统。
抵抗力特点：“三耐四敏” ※耐干燥、耐酸碱、耐孔雀绿（1：13000） ※对湿热、70％乙醇、紫外线、常用抗结核药物（但长
TB是一种革兰氏阳性菌，G+C含量高，其细胞壁 除肽聚糖层外，还含有另外一层由特殊脂质、糖 脂和多糖组成的附加层。TB呈细长略弯曲，常聚 集成团，用抗酸性染色被染成红色。
对养要培求特殊条件，一 般要经4-6周才出现肉眼可 见的菌落。TB通过呼吸道、 消化道和破损的皮肤粘膜 侵入机体，它被吞噬后能 在吞噬细胞内繁殖，导致 巨噬细胞裂解，还可在细 胞外繁殖。