d植物内生菌分离处理方法刘明志。
南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。
热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。
用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。
幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA固体培养基上培养。
红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。
1刘金花。
黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。
２０１１，３３（４）：２７～３０黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的VA培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。
待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。
2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8?13将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗 2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用 2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入 75%酒精中浸泡 30 s,接着用无菌水漂洗 3 次, 平放于 NA 平板上, 28 °C培养 2?3 d。
取最后一次漂洗液涂布 NA 平板作为对照。
内生菌分离和纯化。
将 NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离 1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。
毛豆内生菌的分离及生物学特征观察。
(2011)10- 0026- 02（1）从供试材料上取植物组织 1. 0 g, 用 70% (体积分数 )酒精浸泡 30 s, 用无菌水漂洗后, 置于 1% (体积分数 )次氯酸钠水溶液中表面消毒 3- 5min(其中叶片和花消毒 3 m in, 茎和果消毒 5m in), 再取出植物组织用无菌水冲洗 3次. 样品晾干后分别置于无菌研钵中加 5 mL 无菌水研磨成浆状, 静置 10- 15 m in后, 每一样品各取上层澄清液 50 LL 分别涂布在培养基 ( NA、KB和TSA ) 平板上, 每种培养基涂布 3皿, 28 e 黑暗培养48- 72 h, 计算每一平板的菌落数. 表面消毒后, 在研磨前取 50 LL 无菌水冲洗液涂布平板;或是通过组织印迹试验, 将最后一次清洗的植物组织在培养基平板上印一下, 按上述条件培养 48 h, 观察有无菌落产生, 以验证采用该消毒方法是否能杀死供试材料表生微生物. 根据菌落形态、颜色等挑取单菌落, 划线分离、纯化后保存、备用.在融化并冷却至 45 e 的NA 培养基中加入待测病原菌的悬浮液, 其中每 100 mL 培养基加 1 mL 细菌悬浮液, 倒入平板. 采用点接法将内生菌接种于 NA平板上, 每个平板上等距离点接 5株不同的内生细菌菌株, 每组进行 2次平行试验, 在恒温箱中 28 e 下培养, 2 d后观察有无抑菌圈生成.（2）采用组织切块法, 进行表面消毒,再用灭菌的蒸馏水清洗, 检验灭菌效果。
内生细菌的分离前,将采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分,切取支根 110 cm 长的小段, 须根切成 115 cm的小块, 进行组织表面清毒, 棉花根部切段后经无菌水冲洗 3次,用 75% 酒精浸泡 5m in、7m in、10m in后, 然后分别用011% 升汞溶液处理 4 m in、6 m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复 3次。
最后用无菌水冲洗 4次, 最后一次冲洗液涂 3种不同培养基平板, 26~ 28e 下培养2~ 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗 4次,取上清液涂抹于培养基上。
以无菌水冲洗为对照试验。
培养 2d后观察灭菌效果, 直到彻底表面灭菌, 再进行最后的内生菌分离。
将组织块在研钵中充分研磨成匀浆,取上清匀浆涂抹于 3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复 3次, 然后将培养皿置于26~ 28e 恒温箱中培养2~ 3d, 观察培养出的菌落形态。
（3）再将材料放进经过紫外线消毒的超净工作台内, 切割成小段, 按常规无菌操作进行表面消费处理: 75% 乙醇浸泡 3 min y无菌水冲洗 3 遍 y011% 升汞浸泡 8 m in y 无菌水冲洗 3 遍。
将上述处理过的材料经滤纸吸干水分后, 在无菌条件下切成015 cm@015 cm 的小块, 放置于新鲜的 PDA 平板培养基上, 每个平板放置 4 块, 28 e 恒温培养 3~ 7 d。
待切口边缘长出真菌菌丝, 及时转接至新鲜 PDA 培养基上培养, 采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。
同时, 以消毒后不做切割的材料作为空白对照, 同样条件下观察是否有菌长出, 结果对照材料周围无任何菌长出, 证明表面消费彻底。
212 内生真菌的鉴定: 采用真菌学插片培养方法,对分离获得的见血封喉内生真菌进行显微形态特征( 菌丝、孢子形态等) 的观察、分类鉴定。
分类检索参照文献报道[ 8]。
213 内生真菌的发酵上清液制备: 将分离得到的菌株, 切取黄豆粒大小的菌丝块, 接种于 PDB 培养基中。
1 L 三角瓶装400 mL 培养液, 室温, 164 r/ min振荡培养7 d, 同时以纯培养基作空白对照。
无菌条件下取发酵液 15 mL 于离心管中, 12 000 r/ min 离心 30 min 后取上清液, 用 012Lm 微孔滤膜滤过除菌, - 20 e 保存备用。
214 抑菌活性测定: 采用杯碟法测定样品抑菌活性。
金黄色葡萄球菌和 MRSA 采用 NA 培养基, 白色念珠菌采用 YPD 培养基。
将金黄色葡萄球菌、M RSA 和白色念珠菌分别制成一定浓度的菌悬液( 1@105~ 1@107cfu/ m L) , 用棉签将其均匀涂布在供试无菌培养皿中, 制成含菌平板, 然后在每个平板放入 3 个牛津杯, 分别取样品 200 微升加入其内, 同时以发酵纯培养基作阴性对照。
金黄色葡萄球菌和M RSA 在 37 e 下恒温培养, 白色念珠菌在 28 e 下恒温培养。
24 h 后观察结果, 测量并记录抑菌圈直径。
每个样品做 3 个重复, 以抑菌圈直径的平均值为试验结果4张鑫，生菌的分离方法及其次级代谢产物研究,(2011)02-0023-04内从药用植物圣罗勒的健康叶子上分离出4 种内生细菌 OS －9、OS －10、OS －11和 OS －12。
他们首先将叶子用流水冲洗 10 min，随后于 1% 的次氯酸钠中浸泡 10 min，再用0． 02 mol / L、pH 7． 0 的无菌磷酸钾缓冲液( PB) 漂洗4 次，每次洗后取100 μL 漂洗液转移到装有 5 mL肉汤培养基的离心管中，经过 48 h 震荡培养( 条件是 200 rpm，28 ℃) ，检测样品表面消毒是否彻底。
分离过程为选用紫外线和75%酒精作为表面消毒剂，经过多次消毒，加无菌水将材料研磨后，再将研磨液涂布。
5李铭, 石耳目地衣(2011) 02-0014-07无6刘杰凤, 小白菜内生菌的分离及菌核菌拮抗菌的筛选（2011）13－2676-04健康的小白菜，染病的小白菜。
采回的植株用流水冲洗干净，剪成小段，75％酒精中浸泡3 min，再用10％次氯酸钠浸泡一定时间：茎为8 min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5 min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3 min，表面消毒检测至漂洗液无菌落长出为止，一般为3～4次。
在无菌条件下用适量的PBS缓冲液捣碎，充分搅拌后静置3 min，取上清液0．5 mL分别涂布于分离培养基平板上，每种材料做3次平行，以最后一次的漂洗液作对照，30 ℃下培养一个星期。
挑取不同形态的菌落，平板划线进行3～4次的传代纯化、镜检、斜面低温保存。
选取具有明显菌核菌病症的小白菜，采用常规组织分离方法从长菌丝及菌核处取样，接种于PDA培养基中（添加10％的1 ／ 3 000孟加拉红溶液），30 ℃培养至长出白色菌丝后，取白色菌丝进行多次划线纯化至纯种，斜面低温保存。
7将朱士茂，银杏内生菌的分离与鉴定 2011新采集的银杏枝条，叶子和根放在自来水中冲洗干净，然后将枝条和根截成3 －4cm 长，将叶子和叶柄分开，分别将根，枝，叶放在不同的灭菌后的广口瓶中．之后在超净工作台进行消毒。
根的表面灭菌: 0. 1%的土温 20 消毒 1min，无菌蒸馏水冲洗 2 次，75%的乙醇消毒30s，无菌蒸馏水冲洗 2 次，0. 1% 升汞消毒 5min，无菌蒸馏水冲洗 5 次。
枝的表面灭菌: 75% 的乙醇消毒 30s，无菌蒸馏冲洗 3 次，0. 1% 升汞消毒7min，无菌蒸馏水冲洗 5 次，叶子和叶柄的灭菌: 75% 的乙醇消毒 10s，无菌蒸馏冲洗 3 次，0. 1% 升汞消毒5min，无菌蒸馏水冲洗 5 次，对照实验: ①将以上接入的每种平皿按相同的方法接入 5min 后用无菌镊子取出;②用无菌蒸馏水冲洗已表面灭菌后的材料，然后将此液体移入培养基中，培养观察。
2. 3 内生菌的分离在超净工作台中用无菌镊子挑取根放在无菌培养皿中，将其表皮剥离，用无菌小刀纵切表皮取其中间的部分，然后将其切成0. 5cm ×0. 5cm 大小，插入到培养基中。
茎皮内生菌的获取同上，其次茎的木质部切成半径 1cm 长 2cm 的部分接入培养基中。
叶，叶柄中内生菌的获取一是将叶切成0. 5 ×0. 5 大小接入培养基中，二是用研钵将叶磨碎 ( 内放石英砂和生理盐水) 然后用无菌移液管吸取0. 2ml 放入培养皿中，最后用玻璃涂棒涂布均匀 ( 以上材料均接入五种培养基中，且每种均接三次) 。
对照实验: 将表面消毒过的材料用无菌镊子夹取后在培养基中滚动2min 后弃掉，而且最后一次永无菌蒸馏水冲洗的冲洗液转入到五种培养基中培养( 将上述培养皿放入温箱终于27℃培养) 。
8肖淑贤, 植物内生菌的研究概况及应用进展 2011.01.013分离时可选取长势好、无病害的植株。
分离方法通常是直接切取植物组织或榨取植物组织汁液稀释。