干细胞鉴定模式 ， 该模式适用于体外培养 的肿瘤细胞株 中肿瘤干细胞的鉴定。
肿瘤 干 细胞是 指 肿瘤 细胞 中具有 自我 更新 和多
重 悬并 计 数 。 在 玻 璃 培 养 皿 中预 先 加 入 深 约 ０ ３ ．
ｃ 的完 全培 养基 （ ２ ％ 胎 牛血 清 ） 置 于 ３ ｍ 含 ０ 并 ７℃
验， 观察符合 成瘤性克隆纳入标准的单细胞克隆的成瘤性 。结果 成瘤 性克 隆的纳入标 准 ： 单细胞 种植后 １周 即 形成细胞数 ＞５ 的克 隆 ， ０个 细胞大小形态正常 ， 大部分 细胞 状态 良好 ； ２周时 克隆迅速 扩增至 ＞ ０ 第 ３ ０个 ， 至达 甚 １００ 以上 ， ０ 个 细胞状态好 ， 克隆 中心可有（ 或无 ） 少量细胞 凋亡。符合上述 标准 的单 细胞克 隆可 以 １０ ０ ％扩增 成功 并连续移植成瘤 ， 而相应排除的克隆成瘤率 ＜１％ 。结论 ０
摘要 ： 目的 探讨 适用于体外培养的乳腺癌 ＭＣ ７细胞 中肿 瘤干细胞 的鉴定模 式。方法 取人乳腺 癌 Ｍ Ｆ Ｆ Ｃ７ 细胞株 ， 在显微操作法的基础上改进单细胞分离种植技术 ， 用该技术分离 ＭＣ ７单细胞 并种植 到 ９ 孔板 ， Ｆ ６ 观察单细 胞克隆生长情况并依据其生长特征制订成瘤 性克 隆的纳入标 准。随机扩增 ＭＣ ７单 细胞克 隆并进行 移植成 瘤实 Ｆ
分类 。＠ＭＣ ７单 细胞 克 隆扩 增及 移 植成 瘤 ： Ｆ 随机 扩
１１ 材料 ．
人 乳 腺 癌 ＭＣ ７细 胞 系 购 自中科 院上 Ｆ
海 细胞 库 ， 实验 用 的 ＭＣ ７细 胞 株 为 ＭＣ ７单 细 胞 Ｆ Ｆ 来 源 的亚 株 。Ｒ ＭＩ６０培 养 基 及 Ｆ Ｓ Ｐ １４ Ｂ 。裸 鼠。单 细 胞分 离种植 装 置为 自行研 制 。
月 ， 们 在研 究 中建 立 了单 细 胞分 离 种 植一 成瘤 性 我 克 隆 的 肿 瘤 干 细 胞 鉴 定模 式 ， 在 人 乳 腺 癌 ＭＣ ７ 并 Ｆ 细胞 株进 行 了验证 。现将结 果 报告 如下 。
１ 材 料 与方 法
无菌 ９ ６孔板 内加好 适应 培养 基 ） 。
１２３ Ｍ Ｆ 单细胞克隆成瘤性实验 ＠Ｍ Ｆ ．． Ｃ ７ Ｃ ７单 细胞克 隆 ： 述 ＭＣ ７单 细 胞 种 板 后 培 养 １周 和 ２ 上 Ｆ 周时分 别记 录克 隆 的细 胞 数 ， 察 细 胞形 态 及 其 生 观 长状态 ， 据 克 隆 的细 胞 数 目及 生 长特 点 制 订 成瘤 根 性克隆的纳入标准 ， 照纳入标准 将单 细胞克 隆进行 按
关 键 词 ： 瘤 干 细 胞 ； 隆细 胞 ； 瘤 细 胞 ； 腺 癌 肿 克 肿 乳
中 图分 类 号 ：７ ７ ９ Ｒ ３ ． 文 献 标 志 码 ： Ｂ 文 章 编 号 ：０ ２２ ６ （０ ０ ２ － ２ － １０ －６ Ｘ ２ １ ）６０ ５０ ． ０ ２
建立 了乳腺癌 ＭＣ ７单细胞 分离种植一成瘤 性克隆 的 Ｆ
后即 ＞ ０ ３０个 ， 甚至达 １ ０ ０个 以上 ， ０ 细胞状 态较好 ， 背 景浅且 均一 ， 少 数 克 隆 中心 出现 少量 细 胞凋 亡 仅
现象。
点 。与体 内移植成瘤模式相 比， 体外培 养模 式周期更
短、 条件稳定、 不受免疫因素影响。但体外培养模式 对 于肿瘤 干细胞成瘤性 的观察 相对 有限 ， 只适合 并且 特定类型 的肿瘤干细胞 的鉴定 ， 液肿瘤 的肿瘤干 如血 细胞及适应 了体 外培 养 的肿瘤细胞 株 等 。本 研究 在
式同样适用 于其 他肿 瘤细胞 中干细胞 的鉴定 。
参考文 献 ：
［ ］Ｃａ ｅＭＦ ｉ Ｅ，ＤｒｓＰ ，ｔａ． ａｃｒｓ ｍ ｃｌ——ｐ １ ｌｋ 。Ｄｃ Ｊ ｒ ｋ ｉ Ｂ ｅ １ Ｃ ｎｅ ｔ ｅ８ ｋ ｅ ｌ
ｓ ｅ ｔ ｃ ｎ ｃ ｒｅ ｔ ｓ ｔ ｓ ａ ｄ ｆ ｔ ｒ ｉ ｃ ｉｎ ：ＡＡＣＲ ｏ ｋ ｈ ｐ ｐ ｃｉ ｓｏ ｕ ｒ ｎ ｔ ｕ ｎ ｕ ｕ ｅ ｄ ｒ ｔ ｓ ｖ ７单 细 胞 克 隆 的分类 以 生长 特 点 为 依 ． Ｆ 据 ， Ｍ Ｆ 单细 胞 克 隆分 成 两 类 。第 一类 克 隆 符 将 Ｃ＇ ／
合以下条件 ： ①单细胞种植后 １ 周即形成细胞数 ＞ ５ 的克 隆 ， Ｏ个 细胞 大小 、 态 正 常 ， 形 大部 分 细胞状 态 良好。②第 ２ 周克隆迅速扩增达 ３０— ０ 个 ， ０ １ ０ 细 ０ 胞状态好 ， 克隆中心可有（ 或无 ） 少量细胞凋亡。其
１２４ 统计 学方 法 ．．
义。
采 用 Ｓ Ｓ １． Ｐ Ｓ３０统计 软件 。计
数资 料 比较 用 检验 。Ｐ≤００ 为 差异 有统 计 学 意 ．５
２ 结果
２ １ ＭＣ ７单细 胞克 隆 的生 长情 况 ． Ｆ
ＭＣ ７单 细 胞 Ｆ
２５
种植 后 ２ ， 分细 胞开 始逐 渐凋 亡 、 死 、 ４ｈ 部 坏 分解 、 消
山东 医药 ２ １ ００年第 ５ 第 ２ ０卷 ６期
失， 少数细胞在分裂数次之后逐渐凋亡， 另一部分细 胞则 出现第 １ 分 裂 ， 次 出现 分 裂 的细胞 多 数 在种植 后１ 周形成克隆（ 细胞数 ＞ ０个） ５ 。单细胞克隆的 生长 速度 、 细胞状 态存在 较大异质 性 ， 中部分单 细 其 胞克 隆生长缓 慢或状 态不好 ， 内颗粒多 ， 胞 凋亡或坏 死 的细胞 较 多 。但 多 数单 细 胞 克 隆 生长 迅 速 ， ２周
ｌ ０ 个细胞二次移 植 ， 以观察其持 续成瘤 能力 。
液 时过 滤 收集 的培养 基 ） ｌ １比例配制 。 按 ： １２ ２ ＭＣ ７单 细胞分 离种 植 培养 的 ＭＣ ７细胞 ． ． Ｆ Ｆ 按 常规 方法 进行 消化 、 心 、０ 目细 胞 滤筛 过 滤 后 离 ３０
基金 项 目： 西 研 究 生 教 育 创 新 计 划 课 题 基 金 资 助 项 目 广 （ ０ ８０ ９ １０ Ｄ ３ 。 ２０ １５ ８ ０２ ３ ） ＋ 通讯 作者
山东 医药 ２ １ ０ ０年 第 ５ Ｏ卷第 ２ ６期
乳 腺 癌 ＭＣ ７细 胞 株 中肿 瘤 干 细 胞 Ｆ 鉴 定 模 式 的 建 立
黄 名威 陆 云飞 ， ， 沈桂 鑫 李 ， 涛
（ １广 西 医科 大学 ， 宁 ５０ ２ ； 西 医科 大学 第一 附属 医院 ） 南 ３０ １２广
１２ １ 培 养 基 的配 制 常 规 培 养 基 为 Ｒ ＭＩ６０ ．． Ｐ １４ 培 养基 加 １％ Ｆ Ｓ 适应 培 养基 为含 ２ ％ Ｆ Ｓ新 鲜 ０ Ｂ， ０ Ｂ
Ｒ ＭＩ６ ０培养 基 和 陈 旧 的 培 养 基 （ Ｐ １４ 即培 养 细 胞 换
部分 移植 瘤用 Ⅲ型胶 原酶 消化 获取 单 细胞 悬液 后 取
余克 隆归 人第二 类 。
２ ３ ＭＣ ７单 细 胞 克 隆 形 成及 其 成 瘤 结 果 ． Ｆ ４块 ９ Ｌ ６孑 板单 细胞种 植后 获得 的单 细胞 克 隆数 、 类及 分
连续移植成瘤的克隆命名为成瘤性克隆。成瘤性克
隆形成率可反 映细胞株 中肿 瘤干 细胞 的含 量。本研
各类克 隆 随机 扩 增 并 进 行 连 续 移 植 成 瘤 结果 见 表
显微操作法 的基 础上改 进单 细胞分 离种植 技术 并 结
合体内、 外两种鉴定模式的优点 ， 采用单细胞分离种
植一 成瘤性克隆 的模式 鉴 定 Ｍ Ｆ Ｃ ７细胞 中的肿瘤 干 细胞 。由于单细胞种植 时采用 的是适应培养 基 ， 最大 程 度地 避免 了环境 改 变对单 细 胞克 隆形 成 的影 响 。 单 细胞 克 隆形 成 以后 再 进行 扩 增 ， 用细 胞 数量 优 利 势 ， 了成瘤率 ， 而最 大程 度保证 了实验 结果 的 保证 从 可靠性。我们将单 细胞来 源并 可 以扩 增形 成亚 株 和
１ ２ 方 法 ．
增单细胞克隆 ， １ １ 按 ： 消化传代至新 的 ９ 孔板持续 ６
扩增 ， 继而传 至 ２ 板 、 板 和 培养 瓶 （ 持 续 扩 ４孔 ６孔 能 增 到 ６孔板 的克 隆即判断为扩增 成功的克 隆 ） 。将 单
细胞克 隆 来 源 的 细胞 扩 增 至 足 量 的细 胞 数 （ １。 约 ０ 个） 后移植到裸 鼠前肢腋 下 ， 月后观 察成 瘤情 况 。 ２个
向分化 能力 的 干细 胞 样 亚 群 。 目前 ， 瘤 干 细胞 的 肿 鉴定 金标 准 是连 续移 植 成 瘤 实 验 … ， 实 验通 常需 该
要 采用 免疫 缺 陷 鼠为 移植模 型 ， 鉴定 周期 较长 ， 加上
培 养箱 温育 １ ｉ， 滴 管 吸 取 细胞 悬 液 １—２滴 ， ０ｍｎ用 滴 入预 热 的培 养 基 中 ， 次 在 培 养 箱 温 育 １ ｉ。 再 ０ ｍｎ 显微镜 下用单 细胞 分 离 种 植 装 置 随机 挑 取 单 细 胞 ，
逐 孑 种入 ９ 板 （ Ｌ ６孔 ４块 ） 种 板 前 按 ２ ０ ｌ孑 在 中（ ５ ／ Ｌ ，
移植部位的微环境变化及模型 鼠残余 的免疫排斥反 应， 使得 实验 结果 大 受 影 响 口 。理 想 的肿 瘤 干 细胞 Ｊ 鉴定 方 法应 该具 备 量 化 、 特异 性 和敏 感 性 以及 鉴 高 定周 期短 的特点 ¨ 。 为此 ，０ ８年 ９月 一 ００年 ２ ｊ ２０ ２１
和 ， 隆形成率为实际克隆个数除以总孔数 克
３ 讨论
由于缺乏特异 的生物标记 ， 肿瘤干细胞还是通 过 功 能学即成瘤性实验来鉴 定 。Ｋ ｌ ｅｙ等 将来 源 于转 ｌ 基 因小 鼠的淋 巴瘤 和 白血病 细胞移 植 到组织 相容 的
小 鼠体 内， 结果 显 示 ， ０ 的肿 瘤 细胞具 有成 瘤能 ＞１ ％
１ 。表 １ 显示 ， 第一类克隆的扩增成功率和移植成瘤 率 均 为 １０ ， 第 二 类 克 隆 的 扩 增 成 功 率 低 于 该标准综合考 虑 了克 隆的细胞数 量 、 ０％ 而 生长速 度及细胞 １％ ， ０ 两类克 隆 的成 瘤 率 相 比， ０ ０ 。说 明根 据 状态等影响移植成 瘤结 果 的因素 。根据 这 一标 准人 Ｐ＜ ． １ 本研 究提 出的第 一类克 隆 的条 件可 以有 效 区分 成瘤 选的克隆经过 扩增 、 异种移植后 １０ ０％成瘤 ， 除的 而排 性克 隆和非成 瘤性 克隆 。 克 隆成瘤率低 于 １％。有 了成 瘤性克 隆 的纳入标 准 ０ 表１ ＭＣ ７ Ｆ 单细胞克隆及其成瘤结果 后无需对每个单细胞克隆都进行扩 增和移植 验证 ， 节 省 了研 究 时 间和资 源 ， 为后 续 大规 模 的研 究 奠定 基