论坛里发的都是关于细胞的免疫共沉淀的实验方法,这是我做组织时用到的方法,希望能给大家有点帮助
实验方法如下:
第一步：制备组织裂解物
1. 把组织剪切成细小的碎片。

2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。

取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。

3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。

(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

)
4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。

然后同样离心取上清，用于后续实验。

或
1. 使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。

最好在冰上操作。

以防止蛋白降解
2. 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴，否则将组织保存-80°C以备后用。

3. 每5mg组织加入300ul裂解液，使用玻璃匀浆器匀浆，直至充
分裂解。

4. 用300ul裂解液冲洗刀片两次，然后将组织液在4°C缓慢摇动2小时
5. 12000rpm 4°C.离心20分钟。

轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中（保持冰浴），弃沉淀。

裂解液的体积要根据组织量来确定。

蛋白提取物不能太过稀释一方面避免蛋白的损失，另一方面也减少后续电泳的上样量（如果需要的话）。

蛋白的合适浓度为1-5 mg/ml ，最低不能少于0.1 mg/ml。

第二步：预纯化裂解物
使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合Ig的蛋白去除，随后加入的agarose beads一方面将裂解物中非特异结合agarose 或sepharose beads的蛋白去除，另一方面也将加入的无关抗体和血清蛋白去除。

经过处理的裂解物所得试验结果背景更低、信噪比更好。

但如果最后是使用WB来检测的话，预纯化就不是特别的必要了。

主要步骤：
1. 每1ml裂解物加入50ul和IP抗体来源及亚型相同的无关抗体（例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG）或者正常血清（常用兔血清），冰浴1小时
2. 加100 μl Preotein A/G agarose beads，4°C缓慢摇动10-30分钟
3. 14,000 x g 4°C离心10分钟
4. 取上清，弃沉淀。