➢分辨率高 ➢可连续上样 ➢电泳时间长
➢可消除电荷对迁移率的影响
◆浓度梯度凝胶的 配制
‸需采用梯度混合器，配制时，浓溶液置于混合室，稀溶液置于贮存室
◆碱性电泳系统
‸用pH8.3的电泳缓冲液，电泳向正极进行.下槽接正极，上槽接负极，以 溴酚蓝为指示染料
‸最常用 ‸可用于分析绝大多数的蛋白酶，因为其pI<8.3，即蛋白酶带负电
◆酸性电泳系统
‸采用pH4.0左右的电泳缓冲液，电泳向负极进行.下槽接负极，上槽接正极，以亚 甲基绿作指示染料
‸适用于分析酸性和碱性蛋白，即pI>4.0的蛋白均适用
◆ PAGE的用途
‸分析蛋白酶的纯度
※蛋白泳动与蛋白大小，电荷和形状有关，凝胶兼有分子筛的功能
※电泳的分辨率很高，可以把不同的蛋白酶分开
⊕猪生长激素可能含两种不同的亚基，其中28kD是个普通蛋白；而另 一个亚基则在SDS -PAGE中是向负极泳动，因而被忽视
◆ SDS-PAGE的原理
ₒ巯基乙醇使蛋自中的二硫键还原
ₒSDS破坏蛋白质的非共价键
→使含有亚基的蛋白质解离为各个亚基
ₒ1g蛋白和1.4g SDS结合形成蛋白-SDS胶束。SDS 带大量的负电荷
→各种蛋白-SDS胶束均带负电,且电荷量相近,电泳迁泳率 只取决于胶束(亚基Mr)大小
ₒ SDS与蛋白结合，并引起蛋自构象的变化
越大,泳动速度越快
‽ 溶液pH值 溶液pH值决定了溶液中蛋白酶的带电的性质如带何种 电荷个带电的多少
‽ 离子强度
溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度则越慢。反之则越快。一般电泳溶 液的离子强度为0.02-0.2
‽ 电渗 在电场中，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗
在毛细管电泳中，毛细管是由石英为材料，含硅酸成分， 带负电荷，使毛细管中溶液感应而带正电荷。水分子便向负极 移动，并带动溶液中的蛋白酶等颗粒一起向负极移动
Amino acid Content ( %) Amino acid Content ( %)
Asp
2.03
Thr
1.32
Ser
4.11
Glu
3.02
Gly
4.56
Ala
2.09
Cys
----
Val
5.19
Met
----
IIe
1.13
Leu
1.97
Tyr
2.16
Phe
57.05
Lys
10.15
His
➢胶束中蛋白电荷量不能忽视
ₒ碱性组蛋白和酸性铁氧还蛋白在SDS-PAGE所测亚基 Mr偏高 ※组蛋白亚基Mr为21kD，但测定出为35kD
组蛋白的正电荷抵消了SDS部分负电荷
※铁氧还蛋白的亚基Mr只有8kD，但Rf=0.8
铁氧还蛋白不能和SDS充分结合
ₒ强碱性的精蛋白在SDS-PAGE中会沉淀
可能是精蛋白的正电荷和SDS的负电荷相差无几
三，主要采用的电泳技术(支持物)
‽ 聚丙烯酰胺凝胶电泳
同时具有电荷和分子筛的双重作用，故具很高的分辨率 € Native-PAGE--- 蛋白在天然状态下的电泳 € SDS-PAGE------ 蛋白在SDS变性下的电泳 ‽ 琼脂糖凝胶电泳(核酸电泳)
琼脂糖凝胶为电泳的支持物. 方便但分辨率低 ‽ 醋酸纤维素薄膜电泳
⊿负极泳动的蛋白容易被忽视
⊿解释有些蛋白的电荷不均一性
⊕很多蛋白经一些方法证实是纯的，如SDS-PAGE后只有单带，但IEF 却含多个pI。目前对其中的原因众说纷纭，尚无公认的解释，有人认 为是空间构象不同所引起，但未有确切的证据。 ⊕猪生长激素经SDS- PAGE后只有28kD带，IEF却有6.0-7.2等五个pI。
◆均一胶和梯度胶
⃎聚丙烯酰胺凝胶通常由浓缩胶和分离胶组成
⃎浓缩胶:丙烯酰胺浓度均为4%,起蛋白上样和浓缩的作 用
⃎分离胶:起分离蛋白的作用, 丙烯酰胺浓度可以是相同的 (均一胶),也可以是不同的(梯度胶)
◆梯度胶电泳的特点
※分离胶的丙烯酰胺浓度由上至下形成 从低到高的连续梯度,一般是4%-20%
1.01
Arg
4.21
Pro
-----
Trp
-----
见:梁秀文等.植物绿叶粗蛋白在SDS-PAGE中向负极泳动的富含苯丙氨 酸的碱性蛋白的测定. 热带亚热带植物学报,2006,14（2）：126-129
․植物绿叶乙醇酸氧化酶含有向负极泳动的 蛋白
Fig.SDS-denatured glycolate oxidase from B. campestris ssp. chinensis var. utillis leaves was subjected to SDS-PAGE (A), CE (B) and acetate cellulose membrane electrophoresis (C). The polarity was shown and the arrow indicates the original of protein sample
ₒ如果碱性蛋白和SDS结合率很低，达不到1:1.4,它 就可能向负极泳动。
ₒ碱性蛋白能充分和SDS结合，但其所带正电荷比 SDS负电荷还要多，使蛋白-SDS胶束带正电，同样 会向负极泳动
․植物绿叶粗蛋白中含大量负极泳动的蛋白
负极
正极 菜心绿叶粗蛋白经SDS-醋酸纤维素薄膜电泳,下 方为正极,箭头处为蛋白样品点样的位置
ₒ蛋白-SDS胶束中蛋白/SDS比例并非都是 1:1.4 ₒ蛋白-SDS胶束中蛋白电荷量并非都可以忽视 ₒ同一蛋白能以不同的比例和SDS结合 ₒ蛋白-SDS胶束甚至可以带负电荷
➢胶束中蛋白/SDS的比例并非都是
1:1.4
ₒ空间位阻妨碍蛋白和SDS的充分结合
※糖蛋白:糖蛋白的糖基会形成空间位阻,亚基Mr的 对数与其电泳迁泳率不成线性关系 ※蛋白受体:二硫键丰富,不容易彻底解离为亚基, 所测亚基Mr会偏高 ※含辅酶的复合蛋白，多酶复合体等:其亚基Mr可 能测不准
ₒ蛋白-SDS胶束在水溶液中都成椭圆形，其短轴长 度都为18A左右
ₒ蛋白-SDS胶束长轴的长度和蛋白亚基Mr成正比
➢SDS-PAGE的主要用途 ₒ测定蛋白亚基Mr ₒ研究蛋亚基组成
ₒ研究蛋白纯度
可结合PAGE 、HPLC、IEF等
➢SDS—PAGE的优点
ₒ分辨率高(如果是梯度胶) ₒ精确度高(测定误差不超过10%) ₒ方便易行
四 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
◆ 聚丙烯酰胺凝胶的形成 ※丙烯酰胺和甲叉双聚丙烯酰胺为聚合单体,在聚 合催化剂的催化下,聚合为聚丙烯酰胺凝胶
※聚合的催化剂
▲过硫酸铵和四甲基乙二胺(TEMED)
▲光和化学核黄素
※ 丙烯酰 胺
甲叉双丙 有烯毒酰，液胺体
聚合 催化剂
聚丙烯酰胺凝胶 无毒，固体.
◆聚合单体丙烯酰胺的浓度和凝胶孔径的关系
His
------ - ---- 1.53 Arg
2.53 1.44 3.00
见:曾秋莲等. 植物中在SDS-PAGE中向负极泳动的富含苯丙氨酸的蛋 白的发现. 中国生物化学与分子生物学报, 2006, 22(1):86-90
․发现蛋白-SDS胶束向负极泳动 的意义 ⊿蛋白性质和蛋白组学研究有缺陷
※一条带表明纯度高（电泳纯）
‸分析蛋白酶的全酶分子量
★蛋白酶在电场中的泳动速度 决定于：
⊕蛋白酶形状和大小（全酶分子量） ⊕蛋白酶的净电荷量 ⊕电场强度 ⊕溶液pH值 ⊕离子强度 ⊕电渗
★全酶分子量的对数(Log Mr)和泳动距离成反比
◆ PAGE的局限性
☆如果蛋白酶不同的多聚态并存，纯度高但也可能呈2-3条带
€ 若蛋白酶带负电，泳动速度则变慢 €若带正电，泳动速度则加快
€若不带电，颗粒也会向负极移动
一般要选择电渗较少的固体支持物(不带电)
二，电泳技术的应用范围
‽ 酶的纯度鉴定（分析电泳）
SDS-PAGE、PAGE、IEF（电泳纯）
‽ 酶全酶和亚基分子量测定
SDS-PAGE、PAGE ‽ pI测定
IEF ‽ 酶的分离纯化（制备电泳）
1.98 1.77 1.25
Cys
--- ----- -----
Val
7.49 1.38 1.76
Met
---- ----- -----
IIe
2.32 1.64 0.92
Leu
2.89 2.89 1.66
Tyr
1.48 1.90 2.10
Phe
60.00 65.62 62.30 Lys
10.15 6.17 3.06
不同的蛋白酶的带电性质（带电量和带何种电荷），大小和形状不同，在一 定的电场下，它们的移动方向和移动速度也不同，从而得到分离。
⃈可分离不同的蛋白酶 (制备性电泳) ⃈分析其蛋白性质如分子量和等电点等(分析性电泳)
⃈移动方向
颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所带电荷的种类
※带正电荷的颗粒向电场的负极移动 ※带负电荷的颗粒则向电场的正极移动 ※净电荷为零的颗粒在电场中不移动
☆如果蛋白和杂蛋白的pI相差很大，也要注意有些 杂蛋白容易被忽视，因为两者泳动方向不同
☆蛋白和电泳缓冲液的pH相同，蛋白不会泳动
☆电泳和其它方法如HPLC（高压液相色谱）结合起来，判断蛋白酶的纯度会更可
靠!
五 SDS-PAGE
在十二烷基硫酸钠(SDS) 存在的条件下所作 的聚丙烯酰胺凝胶电泳,称为SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳，简称SDS-PAGE
⃈移动速度
在电场中，颗粒的泳(移)动速度通常用迁移率来表示。 迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度
在电场中的泳动速度主要决定于
‽ 颗粒（蛋白酶）本身所带的净电荷量