钙离子浓度和pH范围因植物种类不同而异。
（例：烟草原生质体融合－－pH10.5，0.05 mM CaCl2）
化学法-3: PEG融合法

诱导融合的机理
PEG具有分子桥的作用：打破电荷平衡
原生质体－水、蛋白质和碳水化合物－（氢键） PEG （氢键） －原生质体
再经高浓度 Ca2 ＋ 和高 pH溶液处理并用培养液清洗，可能 使一种原生质体上的带正电荷的基团连到另一种原生质 体的带负电荷的基团上，导致原生质体融合。
（三）同功酶鉴定
根据亲本和杂种同功 酶谱的差异来鉴别杂 种。有的呈双亲谱带 的总和、有的出现新 谱带或丢失部分亲本 谱带。常用的鉴定酶 为： 乙醇脱氢酶、乳 酸脱氢酶、过氧化物 酶、酯酶等。
（四）DNA分子标记鉴定
是 在 DNA 水 平 上 对 亲 本和杂种植株遗传差 异进行鉴定的一种技 术。 依 据 DNA 的 多 态 性 （polymorphism）

原生质体融合技术主要有PEG融合及电融合 提高融合效率和融合细胞培养重复性是该技 术研究的重点


5. 细胞壁再生
6. 细胞分裂形成细胞团 7. 愈伤组织 8. 植株再生及鉴定
一、 杂种细胞筛选
（一）抗药性筛选
（二）营养（代谢）互补筛选法
（三）物理特性筛选法
（四）荧光标记法 （五）激素互补筛选法
（二）营养互补筛选法

根据其遗传和生理生化特性的互补选择 法
（三）物理特性筛选法

根据可见标记性状 的机械选择法
一 细胞融合
（3）融合体类型

异核体(heterokaryon)或异核细胞
– 基因型不同的原生质体融合成的杂交细胞

同核体(homokaryon)
– 基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞

非对称杂种或细胞质杂种
一 细胞融合
（4）融合类型

自发融合
诱发融合
Flash


对称融合（symmetric fusion）： 两个完整的细胞间的融合
去除细胞壁后裸露的细胞 称 之 为 原 生 质 体 （protoplast）。

（2）特点：
无细胞壁，可以方便地进 行遗传操作、人工诱变、 细胞器转移、细胞融合等 操作。具有全能性，能再 生细胞壁

（3）制备

（4）分离、鉴定与活力分析


1）分离
飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll等。 离心法：低速离心，收集沉淀。


2）鉴定与活力分析
低渗爆破：爆破后是无形的。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨 醇等。 染色发法：有活力的原生质体吸收不同染料显示与死亡细胞不同的颜 色来分析。FDA（二乙酸荧光素）能自由地穿越细胞质膜，在活细胞 内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过 质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活 性。
3 电融合(electrofusion)
将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室
微电极型 两个电极的端部同时与两 个靠近的原生质体膜表面 接触，原生质体由于脉冲 电流间断刺激，两层膜间 产生小孔，连接成桥，经 点连接到面连接，最后形 成融合体。 平行多电极
平行多电极通过1MHz交 流电场发生双向电脉冲， 原生质体在电场力作用 下，极化产生偶极子， 原生质体紧密排开成串 珠状。此时，加入 直流电脉冲，质膜被击 穿，进一步形成融合体
第四章 细胞融合与体细胞杂交
第一节 细胞融合
一 细胞融合
（1）细胞融合(cell fusion)：指用人工方法使两个或以上 的细胞合并形成一个细胞的技术。 （2） 原生质体融合（protoplast fusion)： 两种异源（种、属间）原生质体，在人工控制条件下， 相互接触从而发生膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种 细胞的过程。
2.微生物移植
内吞作用 摄入固氮根瘤菌
质体－涨破－差速离心 （200 g,10 min；1000g，20 min）
转移方法 1. PEG诱导，显微注射 2. 农杆菌介导，基因抢，电穿孔，超声波，激光穿孔
小结
原生质体融合是获得胞质杂种的理想途径。 体细胞杂交在远缘育种和新物种、新资源创 造中具有深远意义。

三、诱导原生质体融合的方法

生物法
病毒诱导 --仙台病毒 较少使用

化学融合(chemical fusion)
定义：利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融 合的方法。 主要种类： 1. 2. 3. 4. 盐类融合法（NaNO3融合） 高pH-高浓度钙离子融合法 PEG融合法 高pH-高浓度钙离子的PEG融合法
融合率： 0.1%~4% 例子：Power（1970），玉米与燕麦原生质体融 合
化学法-2: 高pH-高浓度钙离子融合法

Keller 和 Melchers(1972 ， 1974) 首先发现高 pH- 高浓度钙离 子的诱发融合效应。

机理： 钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体 膜的结合； 高pH又能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合。
Random Amplified Polymorphic DNA
三、 细胞质工程(cytoplasmic engineering)
1.概念 细胞质工程（细胞拆合工程）是通过物理或化学 方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间 核质的重新组合，重建成新细胞。
2.细胞质工程的应用 可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研究和 育种工作。
PEG融合技术的要点

融合液配置
A液：CaCl2
2~8mM KH2PO4 0.5~0.7mM 甘露醇或山梨醇 0.1~0.2mM PEG（分子量6000） 25%~30% pH 5.8
B液：CaCl2
KH2PO4 甘露醇或山梨醇 pH
2~8mM 0.5~0.7mM 0.1~0.2mM 7.0~10.0
PEG融合比较起来，电融合的优点：
不存在对细胞的毒害问题
融合效率高 融合技术操作简便
电融合参数 （例：马铃薯，融合率>40%）
交变电场的振幅频率 交变电场处理时间 支流高频电压 脉冲宽度
脉冲次数
100 V/cm 20s 1100V/cm 60us 1
四、影响原生质体融合的因素
1. 原生质体质量至关重要，高质量的原生质体是细 胞融合的首要条件。 2. 融合方法 3. 融合参数，包括各种融合液都应选择适当。
第二节 体细胞杂交
体细胞杂交

体细胞杂交（somatic cell hybridization）： 是指将不同来源的体细胞融合并使之分化再生、形 成新品种的技术。 体细胞杂交过程 1. 亲本选择（杂种细胞筛选标记） 2. 原生质体制备 3. 原生质体融合 4. 融合细胞筛选
形态、大小颜色
（四）荧光标记法
•。
• FITC(异硫氰酸 荧光素)在荧光显 徽镜下呈绿色 • RITC (异硫氰酸 罗丹明) RITC在荧 光显徽镜下呈红色
（五）生长互补筛选法
矮牵牛+爬山虎融合体的选择
二、 杂种植株鉴定
（一）形态学鉴定
根、茎、叶、花形态颜色
（二）细胞学鉴定 利用染色体显带技术，以亲本染色体为对照，对细 胞杂种的染色体数目、形态和带型进行观察。

非对称融合（asymmetric fusion）：
核失活 （X或r射线处理） 非整倍体 细胞质失活 （丢失）
一 细胞融合
（5）融合步骤
① ② ③ ④ ⑤ ⑥
亲本选择（单细胞或原生质体制备）
两原生质体或细胞互相靠近，粘附 质膜融合形成细胞桥
胞质渗透
细胞核融合 融合细胞筛选
二、原生质体及其制备

（1）定义：
化学法-1: NaNO3融合法

机理：
NaNO3能诱导原生质体融合的原因是钠离子能中和原生 质体表面的负电荷，使凝聚的原生质体质膜紧密接触， 促进细胞融合。
原 生 质 体 表 面 带 有 负 电 荷 ( 在 -10 和-30mV之间)，同性质电荷彼此凝聚的原生质体质膜无 法靠近到足以融合的程度。

化学法-4:高pH-高浓度钙离子的PEG融合法
3 电融合(electrofusion)
定义：
利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再施 以瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿而使原生质 体融合的方法。 基本原理： 在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷 和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并 发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和 成完整的膜形成融合体。
3. 概念：细胞质杂种
应用细胞融合技术，使两种来源不同的核外 遗传物质与一个特定的核基因组结合在一起
4. 细胞质杂种获得途径（4条）：
（1）一个正常原生质体与一个去核原生质体融合； • Lorz等（1981）用密度梯度离心（5％~50% Percoll，20000~40000g，40~90min）获得高纯 度的去核原生质体。
PEG融合技术的要点

融合原生质体的密度和比例 密度：1×105 个/毫升 比例：1:1

融合 融合原生质体溶液 0.1~0.5ml，静置3～5min 融合液A 0.1~0.5ml，保持15~20min，25℃
融合液B 0.1~0.5ml，保持10~20min，25℃
培养液洗涤（3～4次），离心（100×g，5min）
（2）细胞核移植 • 细胞核的来源 植物组织－机械法（加Triton X-100）－过滤离心 原生质体－低渗涨破(加Triton X-100)－过滤离心
• 细胞核的纯化 Percoll或蔗糖密度梯度离心
• 细胞核的转移 夹层离心法：原生质体－核－原生质体－核∙∙∙ PEG诱导 电场诱导和微注射