7.2 生物芯片的分类
按载体材料分： • 玻璃芯片：荧光背景低、应用方便，
材料易得，应用最广泛。 • 硅芯片 • 陶瓷芯片
按点样方式分
• 原位合成（ loci-synthetic DNA ）芯片 ：利用半导体光
蚀刻技术原位合成一定长度（~20 bp）的寡核甘酸片段。
• 微阵列（ microarray ） 芯片 ： DNA 直接点样（针点或喷
靶基因样品的标记
• 靶基因样品被标记后，与芯片上的探针分子杂交。
• 荧光标记；生物素和放射性同位素标记
• 双色荧光标记：常用标记物为荧光素Cy3和Cy5 ，分别用来 标记两中不同的样品（如样品和对照）。 • cy3：激发波长550 nm，发绿色荧光。 cy5：激发波长649 nm，发红色荧光。
标记方法
基因芯片技术的发展简史
Southern & Northern Blot
Dot Blot
Macroarray
Microarray
• 1989年，Southern获得在刚性载体表面固定寡聚核苷酸及 杂交法测序的专利 • 1992年， Affymetrix公司成功应用光导向平板印刷技术， 直接在硅片上合成寡核甘酸点阵的高密度芯片，是世界上 第一块原位合成的基因芯片。 • 1997年，美国Stanford大学Brown实验室，制作了世界上 第一张全基因组芯片（含有6116个基因的酵母全基因组芯 片）。
7.5 基因芯片的应用
• • • • • • • • 基因表达分析 基因型及多态分析 杂交测序 核酸和蛋白质相互作用的研究 疾病的诊断与治疗 药物开发 营养与食品卫生领域 环境科学领域
参考书
• 马文丽 等，DNA芯片技术的方法与应用， 广东科技出版社，2002 • 马立人等，生物芯片，化学工业出版社， 1999（第一版）
第七章 基因芯片技术简介
7.1 生物芯片简介 7.2 生物芯片的分类 7.3 基因芯片的制作 7.4 基因芯片的杂交及结果分析 7.5 基因芯片的应用
7.1 生物芯片简介
• 生物芯片（ biochip ） 又称 微阵列 (microarray) ， 是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在 硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵 列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命 科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以
Light directed oligonucleotide synthesis
光敏保护基团
激光点光源的照 射下，除去光敏 保护基团，使活 性基团暴露出来
光刻掩膜
单核苷酸偶联 光敏保护基团
接触点样法
• 将样品直接点在载体上，仪器结构简单、 快速、经济，目前应用最广泛。 • 10,000个点/3.6 cm2 • 样品需预先合成和纯化，保存好。
基因差异表达分析芯片
• 属于表达谱芯片的一种，目前应用最广泛。 • 主要用于分析两组来源不同的mRNA转录 丰度的差异。 • 两组样品分别用不同的荧光素标记（cy3、 cy5），同比例混合并同时与DNA芯片杂 交，通过计算两组样本杂交信号的比值并通 过设立域值，来确定已知基因在不同来源样 本中表达的差异的基因，甚至发现新基因。
基因芯片扫描结果
不同的颜色代表一个探 针点杂交上的带荧光标 记的核酸分子数的差异。
数据处理和分析
• QuantArray微阵列分析软件，对芯片上的每个点进行鉴 定、确定杂交背景，计算每个点的杂交信号强度。 • 标准化处理：校正荧光标记物的标记和检测效率之间的 差异，分析两个样品的RNA起始量之间的差异。 • 比值分析，鉴定差异表达基因 • 生物信息学分析（如 cluster 算法、差异基因的同源性 比对，差异基因的相关文献检索等）
喷墨法
Switching Valve
阀
Connecting Tubing High-Speed 真空管 MicroSolenoid Valve Removable Tip Orifice
孔
Syringe Pump
Reservoir Controller
探针的固定化
• 针式或喷墨打印探针 后，要通过紫外线交联 或Schiff碱连接法，将 探针固定在支持物表面
标记方法
• 荧光标记的核苷酸非聚合酶的天然底物，掺入效率比天然底物低很 多；对于两种不同的样品材料，不同的荧光素标记物在反转录过程 中掺入到cDNA中的效率有可能不相同，从而造成假阳性。 • 后标记技术：cDNA合成过程中，先不加入荧光素标记物，而是先 在两种材料中都加入同一种带化学活性基团的核苷酸类似物氨基烯 丙基 -dUTP(aminoallyl-dUTP,aa-dUTP) ，从而保证两种材料中标 记物的掺入效率完全一致，纯化得到aa-dUTP标记的cDNA后，通 过aa-dUTP氨基烯丙基与Cy3和Cy5上N-羟基丁二酸亚胺树脂相结 合而标记不同的荧光素标记。
• 末端标记：在引物上标记有荧光素，在DNA扩增过程时，使新 形成的DNA链末端带有荧光素。 • 随机插入：选择四种碱基，使其中一种或几种挂有荧光素，在 PCR过程中，带有荧光素的碱基掺入到形成的DNA链中。 • 反转录标记：以mRNA（或总RNA）为模板，利用随机寡核甘 酸或oligo-dT为引物进行反转录，带有荧光素的碱基就会掺入 到新合成的单链cDNA中。
针式点样
• 点样针从96孔或384孔板上吸取 固定量探针溶液，把探针点到 玻片表面，让探针末端的化学 基团与玻片表面的基团形成共 价键。
Best!
喷墨法
• 将样品用喷嘴喷射到载体上，喷嘴不与芯片接触。 • 用微孔板装载预合成探针溶液，喷头从微孔板吸取探针溶 液，由电脑依据预定的程序自动控制打印喷头在芯片支持 物上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的探 针试剂（不足纳升）喷印到特定位点。
点），密度高、制作方便，应用最广泛。 • 电 定 位 （ microelectronic ） 芯 片 ： 利 用 静 电 吸 附 原 理 将 DNA定位在带电材料上。制作工艺复杂，点样密度低。
按芯片使用功能分
• 测序芯片 • 表达谱芯片 • 基因差异表达分析芯片
测序 芯片
表达谱芯片
• 将克隆到的基因特异的探针或其cDNA片段固 定在芯片上，对来源于不同的个体、组织、 细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变及刺 激细胞内的mRNA或cDNA进行检测。 • 寻找与疾病、突变等相关的基因，对基因间 相互作用进行研究。
杂交
• 将杂交溶液覆盖芯片的探针，用盖玻片覆盖，即可杂交。 • 与常规分子杂交过程基本相似：封闭、预杂交、杂交、洗脱。 • 芯片杂交炉 （Hybridization oven，Affymetrix公司）：全 自动控制芯片的杂交过程。温度控制精确，芯片舱的转动提 供充分的混合。可同时处理64张芯片。
申请
7.3 基因芯片的制备
• 原位合成:通过特定的技术在芯片的
特定区域原位合成寡核苷酸。
• 预合成后点样法：预先合成DNA或
制备基因探针，点样系统把这些合成好
的探针样品涂印或喷涂在载体上。
显微光蚀刻技术DNA合成法 原位合成(In Situ Synthesis)法
• 结合半导体工业中的光蚀刻技术和DNA的化学合成 法，在各个点400,000个点/1.6 cm2。 • 制作时间长，价格昂贵。
杂交信号检测
• 基因芯片杂交结果要用专用的激光 共聚焦扫描系统读取 D A B C B E
完全配对杂交 分子荧光最强 不完全杂交分子荧 光1/35~1/5 不杂交分子背 景荧光
放大器
数模转 换器
计算机 A:激光器 B:滤光片 C:二色镜 D:反光镜 E:关栅
ScanArray扫描仪
• 采用氩离子激光器来激发荧光分子来产生定量的杂交信号。 • 可扫描芯片上成千上万的探针，扫描的同时给出高分辨率的实 时的图像，同时荧光亮度的数据储存在原始文件中。 全自动检测及分析系统 适用于DNA芯片应用 激光共聚焦扫描系统 灵敏度极高 分辨率极高 多种激发及检测通道 适用于多种生物标记荧光探针
基因芯片分析流程
样品制备、标记 芯片制备
杂交
杂交信号检测
数据分析
基因芯片技术的特点
• 微型化，所需试剂用量少 （ ng 级 mRNA、 μl级杂交液）。 • 高通量性 • 平行性 • 高度自动化 • 缺点：在同一温度下杂交，不同探针杂交 效率不同；仪器、试剂昂贵。
芯片点样仪；杂交仪；芯片扫描仪
探针DNA分子的制备析得到 代表各个基因的序列数据，然后通过 PCR 扩增 或DNA固相合成得到所期望基因的片段。 • 人工合成的寡核苷酸片段 • 双链或单链的DNA或RNA片段
7.4.1 靶基因样品的制备与标记
• 靶基因样品来源： PCR产物：序列分析 RT-PCR产物：基因表达分析 • 一般一张芯片杂交需要3 μg mRNA样品 • 因个体差异、匀浆、研磨损耗等原因，送检样品应多1~2倍。 • 样品保存时应保证避免RNase的分解作用
实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、 快速、大信息量的检测。
基因芯片（gene chip）
• 又称DNA芯片（DNA chip）或DNA阵列（DNA microarray），是生物芯片的一种。 • 是将DNA分子固定于支持物上，并与标记的样 品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来 判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中 mRNA的表达量，也可进行基因突变体的检测和 基因序列的测定，为进一步了解基因间的相互关 系及基因克隆提供有用的工具。 • 1998年度世界十大科技进展之一。