辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性李忠琴1 许小平2 杨海麟1 王武#11（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214036） 2（福州大学化学化工学院，福州350002）摘 要 研究了以辣根过氧化物酶-苯酚-4-氨基安替比林反应显色新体系，检测黄嘌呤氧化酶（XOD ）活力的新方法。

确定该酶活性测定的最佳条件为：辣根过氧化物酶（HRP ）7000U /L ，4-氨基安替比林（AAP ）1mmol /L ，苯酚（PA ）6mmol /L ，黄嘌呤（XAN ）1mmol /L 溶于50mmol /L Tris-CL 缓冲液（pH 8.4）；反应温度为37℃，保温时间为20min ；检测波长为508nm 。

本方法测定XOD 酶活的线性范围为5.0～100.0U /L ，线性关系良好（r =0.9992），检出限为1.3U /L 。

该方法操作简单易行，测定结果准确可靠。

可有效应用于普通实验室和临床常规生化检测。

关键词 黄嘌呤氧化酶，辣根过氧化物酶，酶的活力测定，分光光度法2005-08-30收稿；2005-12-05接受本文系福建省自然科学基金（No.C0410006）和工业生物技术教育部重点实验室基金（No.KLIB-KF200502）资助项目1 引 言黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase ，XOD ，EC 1. 2. 3.22）是一种钼羟类胞质缀合酶。

主要用于痛风、心肌梗塞和细胞损伤后次黄嘌呤和黄嘌呤水平的检测［1～3］。

目前测定黄嘌呤氧化酶活力主要采用NBT /MTS-PMS 比色法、紫外分光光度法、电化学法及放射化学法［4～8］等方法。

但比色法形成的显色物溶解度低，PMS 对XOD 活性有一定的抑制，且NBT 、MTS 和PMS 试剂昂贵。

紫外分光光度法中黄嘌呤和尿酸的紫外吸收波长较接近，直接进行紫外检测，干扰严重。

其余两种方法操作繁琐，仪器设备要求高而难于推广。

本实验根据辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ）［9］和黄嘌呤氧化酶的反应特性，提出了用XOD 偶联辣根过氧化物酶，直接测定黄嘌呤氧化酶活力的新方法。

2 实验部分2.1 仪器和试剂U-300型紫外-可见分光光度仪（日本日立公司）；H.H.S 11-2R 恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；高速冷冻离心机（日本Hitachi CR22G 型）。

0.67U /mg 黄嘌呤氧化酶（Sigma 公司）；250U /mg 辣根过氧化物酶（上海双向西巴斯科技有限公司）；4-氨基安替比林（AR ，华东师范大学化工厂）；苯酚（AR ，国药集团上海化学试剂公司）；黄嘌呤（99%，Fluka ）；Tris （BR ，国药集团化学试剂有限公司）；HCL （AR ，国药集团上海化学试剂公司）；叠氮钠（BR ，厦门新隆达试剂有限公司）。

2.2 实验方法配制反应显色液：4-氨基安替比林（4-Aminoantipyrine ，AAP ），1mmol /L ；苯酚（phenic acid ，PA ），6mmol /L ；Tris-HCL 缓冲液，50mmol /L ；叠氮钠，0.02%；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ），7000U /L 。

在具塞试管中，依次加入3mL 反应显色液，黄嘌呤（xanthine ，XAN ）溶液100µL ，黄嘌呤氧化酶（XOD ）酶液50µL 。

混匀，在37℃下加热20min ，煮沸5min 终止反应。

以不加XOD 反应体系作为参比，测定UV-Vis 谱。

2.3 样品处理Arthrobacter g-X 菌株液体发酵48h 后，在10000r /min 转速下离心15min ，收集细胞。

再将其悬浮于50mmol /L Tris-HCL 缓冲液（pH 7.5）中，采用250W 超声处理15min 。

然后用12000r /min 转速离心10min ，取其上清液测定酶活。

第34卷2006年6月分析化学（FENXI HUAXUE ） 研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry第6期821～8243 结果与讨论3.1 酶法测定原理黄嘌呤氧化酶在催化黄嘌呤氧化的反应过程中，每氧化1mol 黄嘌呤，将消耗1mol 分子氧和水，产生1mol 尿酸和1mol H 2O 2。

H 2O 2再经过氧化物酶作用分解，可使4-氨基安替比林与苯酚形成亚醌类呈红色的化合物（chromogen ）［10］。

在可见光范围内测定该显色化合物的吸光度，即可推算出XOD 的酶活。

总反应式如下：Xanthine +O 2+H 2O 7%XODUric acid +H 2O （1）H 2O 2+AAP +PA 7%HRD chromogen +H 2O（2）3.2 反应体系主要参数的确定3.2.1 吸收光谱全波长扫描分析 按实验方法依次加入除XOD 的所有试剂，以Tris-HCL 缓冲液为参比，扫描该体系的UV-Vis 图谱。

如图1曲线1所示，仅在紫外区有1个吸收峰。

加入XOD 反应后再扫描体系的UV-Vis 谱。

从谱图曲线2可看出产物在可见光区450～650nm 之间只有1个吸收峰，选择吸收峰值最高的波长508nm 作为XOD 酶活检测波长，可降低干扰。

图中曲线3在可见光区没有任何吸 图1 XOD 检测反应体系的UV-Vis 扫描图谱Fig.1 Absorption spectra for system of anthine oxidase catalyzing reaction1.加黄嘌呤氧化酶前的体系（without xanthine oxidase ）；2.加黄嘌呤氧化酶后的体系（with xanthine oxidase added ）；3.不加辣根过氧化物酶的体系（without horseradish peroxidase ）；检测条件（determination conditions ）：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ）7000U /L ，4-氨基安替比林（4-aminoanti-pyrine ，AAP ）1mmol /L ，苯酚（phenic acid ，PA ）6mmol /L ，黄嘌呤（xanthine ，XAN ）1mmol /L ，黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase ，XOD ）49.3U /L 。

收峰，说明若不添加辣根过氧化物酶，体系无法形成红色亚醌类化合物，即不能进行XOD 的检测。

3.2.2 酶促反应温度的确定 在相同反应条件下，考察了不同反应温度对XOD 酶活的影响。

结果表明（表1），随着温度的升高，体系吸光度先增大后减少，即显色物的生成量先增后减。

在37℃时，显色物的吸光度最高。

因而选择37℃作为检测温度，可获最佳反应效果。

表1 温度对XOD 酶促反应体系的影响Table 1 The effect of temperature on the XOD reaction system温度（℃）Temperature3235374048A 5800.23280.27970.31930.28050.2631反应条件（reaction conditions ）：t =20min ；pH 8.6。

3.2.3 酶催化反应动力学性质 分别按3.2实验方法同时进行反应，在反应后1、3、6、9、10、12、13、18、20、25及30min 时终止反应，测其吸光度，结果见图2。

由图2可以看出，在XOD 加入测定体系后，吸光度值随反应时间增加逐渐增大。

在20min 后，吸光度值达到最大，用A max 表示。

用一级动力学方程描述吸光度与时间之间的关系曲线得到图3，结果显示该体系反应很好地符合一级反应，动力学方程为：ln （A max -A t ）=-0.1724t -1.2326，相关系数r =0.9973。

虽然体系中包含两步酶反应，但是由于HRP 的催化效率极高，H 2O 2一经生成立刻分解出初生态氧，而且H 2O 2氧化苯酚反应比黄嘌呤的氧化反应要快得多，故该体系的综合反应是准一级反应。

3.2.4 酶促反应体系pH 的选择 在XOD 和HRP 两种酶的稳定pH 范围内，考察了6个不同pH 对酶活力的影响。

结果表明（表2），pH 对反应体系有明显的影响。

在pH8.0～8.4范围内，随着pH 的提高，显色吸光度增大。

故确定该反应体系的最适pH 为8.4。

表2 体系pH 对XOD 酶活检测的影响Table 2 The effect of pH on the determination of XOD reac-tion systempH 7.58.08.28.48.69.0A 5080.13390.13850.17540.18010.15270.1262反应条件（reaction conditions ）：T =37℃，20min 。

228分析化学第34卷图2 反应体系测定XOD 的吸光度随时间变化的曲线Fig.2Curve of absorbance versus time in reaction system反应条件（reaction conditions ）：T =37℃，pH 8.6。

图3 XOD-HRP-PA-AAP-XAN 反应体系的动力学曲线Fig.3 Kinetic curve of the XOD-HRP-PA-AAP-XAN re-action system反应条件（reaction conditions ）：T =37℃，pH 8.6。

3.2.5 根据米氏常数选择黄嘌呤底物浓度 分别以0.062、0.099、0.308、0.615和1.231mmol /L 等不同浓度的黄嘌呤为基质对相同浓度XOD （49.3U /L ）的酶活进行测定，观察底物对酶促反应速度的影响。

根据Lineweaver-Burk 双倒数作图法，线性方程为（1/S ）=2.9619×（1/V ）+60.896，相关系数r 为0.9987，求得黄嘌呤氧化酶的米氏常数为K m =0.049mmol /L 。

在酶活测定中，要求底物浓度过量，一般应大于10倍K m 值［11］。

根据该实验结果说明在本文中采用的1mmol /L 黄嘌呤作为测定体系的底物浓度是适宜的。

3.2.6 测定方法的建立 首先取3mL 反应显色液（pH8.4）于具塞试管中，加入100µL 黄嘌呤溶液（1mmol /L ），在37℃水浴中预热1min 。

然后加入50µL 标准XOD 酶液或发酵XOD 酶提取液，混匀保温20min ，沸水煮5min 终止反应。