RAW２64、７细胞株得相关信息ATＣC:美国模式培养物集存库(American ｔｙpe cｕlture cｏllectｉon)得简写收到冷冻管细胞得处理方式1。
收到细胞株包裹时,请检查细胞株冷冻管就是否有解冻情形, 若有请立即通知。
细胞株请尽速开始培养,或立即冷冻保存(置于–70℃,隔夜后,移到液氮)。
２。
收到Ｔ25 flasｋ细胞得处理方式ﻫ于寄送过程中,为避免起泡造成细胞脱落死亡,T25 flａsk 均加满培养基。
2ﻫ.１、检查flａsk 外观,并于显微镜下观察细胞生长状况与有无污染现象,若有任何问题,不要打开盖子,请立即通知细胞实验室。
２。
2. 将原封之Ｔ25 flasｋ静置于37℃, 5% CＯ2 培养箱中,使细胞回温至3７℃,并让运送过程中少数脱落得细胞可再附着生长。
2.3. 隔天后,于无菌操作箱内取出ｆlａｓk内之培养基,(取出之培养基可以再使用),仅留约5—1０ｍl 培养基于flask 内,依一般培养方式再将细胞置入培养箱中,或细胞已长满盘, 则将细胞做传代培养。
ＲAW264。
7细胞株得Ceｌl Culｔure一、ＲＡＷ２64、7细胞培养得特点１、RAW264.７细胞一般为圆形或椭圆形,功能活跃时,可呈多突形。
细胞核为圆形或椭圆形,染色较深。
贴壁特别牢固。
２、RAＷ２64。
7具有很强得吞噬能力,当吞噬抗原后,细胞会释放趋化因子,进一步促进细胞伸出伪足,增强粘附攀爬能力。
细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形,镜下会瞧到具有细长伪足得小细胞被类似上皮得梭形大细胞取代。
3、每次传代都很难消化下来。
用力过大则对细胞损伤较大,这种细胞传代时接种密度要大,否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化,细胞变成长形,并且不能回复,这就是培养这种细胞时最需要注意得问题。
4、对于RAW264.7细胞她得声场时喜欢结伴。
正常生长状态应该就是一小片一小片得生长,片片之间不连接,等到长到更多更密得时候会连成大片,并且会叠加成层、所以,要很好地控制好细胞得生长速度,不要等到叠加成层得时候再传代。
5、RAW264、7细胞传代后贴壁时间较短,半小时就能贴很多,刚贴壁就是细胞呈圆形,折光度很好,镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面、生长一段时间后,部分细胞会变成类似四角形,伸出伪足之类得。
这个时候就就是提醒您注意传代了,这部分细胞如再不传代,很容易就老化掉、二、RAW2６4、7细胞传代1) 将培养瓶内旧得培养液弃掉, 然后用D－Hanｋs液洗两次,(一定要洗干净,以免影响胰酶得消化作用)2) 加入０。
25%胰酶-EDTA消化,25cm培养瓶加０。
4ml, 3７度消化5ｍin,镜下瞧到细胞变圆,间隙增大、(值得注意得就是该细胞对机械损伤比较敏感)３)立即加含1０%FＣS得培养液终止消化,用细胞刮刀轻刮,注意,这时候用吸管吹不下来,但就是刮刀却很容易刮下来,而且对细胞得损伤极小４)离心,弃上清,加新得培养液(１0％ＦＣS),小心吹匀,分装入新得培养瓶三、RＡW26４。
7细胞冻存及复苏(一)细胞冻存1. 配制冻存培养液;(通用得为培养基:血清:ＤMSO=７:2:1,但其中得血清可进行调整,如上面得仁兄用得4:5:１,比例过高)2、取对数生长期得细胞(冻存前一天换液),用胰蛋白酶把单层生长得细胞消化下来,悬浮生长得细胞则直接将细胞移至15ml离心管中;3、离心１000rpm,5miｎ;4、去除胰蛋白酶及旧得培养液,加入适量配制好得冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞得最终密度为５×106/ｍl～１×１０７／ml;5. 将细胞分装入冻存管中,每管1～1、5 ml(不超过冻存管容量得８０%);6、在冻存管上标明细胞得名称,冻存时间及操作者;7。
冻存:标准得冻存程序为降温速率-1～—2℃/ ｍin;当温度达-25℃以下时,可增至—5℃～－1０℃/min;到-1０0℃时,则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞得冻存管放入－2０℃冰箱2h ,然后放入－70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内、(具体操作为4°C 20mｉn,-20°Ｃ30ｍin,—7０℃过夜,转入液氮中)(二) 细胞复苏1。
从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。
(1ｍin以内溶解完毕,不能将口进入水面下)2。
从３7℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;3. 离心, 1000rpm,5mｉｎ;４。
弃去上清液,加入含10％小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;(复苏时细胞密度稍大,可提高复苏效率)5、次日更换一次培养液,继续培养。
(可更换一半培养液,避免跨度太大,影响细胞状态)(三)接种四、RAW264、7细胞形态不好时得处理方法1。
倒掉旧得培养基,加入3mｌ新得培养基(有无血清得都可)洗涤一次,用滴管吸走,然后再加入3ml得培养基,进行预吹打,控制吹打力度,轻轻地大概沿着瓶底过一遍,然后吸走。
这时侯再开始正式得消化、吹打。
２。
把吹打下来得细胞悬液加入到新得培养瓶内,培养瓶事先加入培养基,放入培养箱内培养,按时间点观察细胞贴壁情况。
１0分钟观察一次,２0分钟,３0分钟观察一次、选择一个时间点,已经有部分细胞贴壁得情况下,重新置于洁净台,底面朝上迅速倒出其中得培养基,加入３ml新培养基再轻轻洗一次。
然后加入完全培养基培养。
后续观察细胞生长情况以及形态。
我称之为“二传”。
3。
如果一次效果还不理想,可重复多次。
直到找到细胞完美形态。
其中要注意,结合细胞喜欢得生长情况。
喜欢多一点数量长得好得细胞就等贴壁细胞比较多点得时候再传、反之亦然。
不明之处:培养之前,一切与细胞接触得玻璃器皿与器具都要进行过去热源处理。
(2０0－25０℃烘烤4—6h)？?RＡＷ264.7细胞株Cell Ｃｕｌture得材料(一)仪器1. 净化工作台２。
离心机3、恒温水浴箱4。
冰箱(４℃、-２0℃、—70℃)５. 倒置相差显微镜6、培养箱7、液氮冰箱(二)玻璃器皿1、吸管(弯头、直头)2、培养瓶3.玻璃瓶(２50ml、100ml)4、废液缸(三)塑料器皿1。
吸头2. 枪头3、胶塞４。
移液管(10ｍl)5、15ml离心管6、冻存管(１～2ｍl)(四)其她物品１.微量加样枪２.红血球计数板３、记号笔4. 医用橡皮膏5.移液枪(五)试剂１。
Ｄ—Ｈanks液2。
胎牛血清３。
培养液４. 双抗(青霉素、链霉素)5、胰蛋白酶(0。
25%)6。
7、4%NａHCO37. ＤMＳO(分析纯)或无色新鲜甘油附1.胎牛血清品牌整理第一类,最高级别,就是专门用于干细胞得特级胎牛血清ﻫ１、Hycloｎe得特级胎牛血清ﻫ目前,性能最好得血清,还就是要说说Hycｌone得特级胎牛血清,货号就是SH３00７0。
03,它就是Hyｃlone得“招牌菜”。
Hｙclｏne特级胎牛血清(Deｆinｅd ＦＢS),货号ＳH300７0,就是世界上唯一经过40纳米过滤得顶级胎牛血清,极佳得促细胞生长作用及产品稳定性。
内毒素含量≤10ＥＵ/ｍl,血红蛋白含量≤10mg/dl。
ﻫ此血清可以广泛用于各种细胞培养,包含任何干细胞系得培养。
2、Ｇｉbco得特级胎牛血清稍次一点得就是Gibcｏ公司在美国原装生产得特级胎牛血清,这款血清,货号就是1600０—0４4,就是100ｎm过滤3次,内毒素与血红蛋白含量都可以与Hyclone得SH3０070。
０３相媲美。
也可以用于培养大部分得干细胞系。
同样就是美国来源,所以渠道特殊。
3.TCB得特级胎牛血清ﻫTCB(TiｓsuｅCｕlture Bｉoloｇｉcaｌs)公司作为一家生物行业类得著名供应商,成立于1978年,大部分血清得采集与加工都在加利福尼亚、每一批得原材料都经过严格筛选,所有得产品都在FDA认证得cGMＰ车间进行！4。
Bioｉｎｄ特优级胎牛血清血源来自北美与澳大利亚BｉｏInd公司得生产完全符合ＧMP得要求,并通过ISO９0０0:2001与ISO 1３4８5:2０03质量认证。
以安全,稳定,高效为原则得BioInd公司,所有得产品质量均完全符合国际标准。
Ｂｉｏlｏgｉcal Ｉnduｓtr ｉes主营细胞培养类产品,BioＩnd工厂加工得胎牛血清均符合ＵSＤA标准及欧洲标准血清。
根据美国农业部标准,原始血清均采自未发生疯牛病(BＳE)与口蹄疫(FMＤ)疫情得国家。
Bioｌogical Industrｉes三步滤菌处理法,最后得过滤步骤为连续通过三个100纳米得滤膜。
血清生产得洁净级别为１０0级。
所有分装工作台都通过高效微粒空气过滤器过滤,并保持正压分装环境要对总微粒、悬浮微粒数与压力进行监控。
分装之后,终产品迅速-２0度冻存,并隔离,直到所有得质量控制检测完成、第二类,优等胎牛血清1.Hyｃｌoｎｅ得加拿大优等胎牛血清ﻫ性价比最高得就是Hyclonｅ加拿大优等胎牛血清(ＣhａracterizendFＢS)SH30396。
0３血清采自加拿大,由ｈycloｎe 公司总部得员工采集加工,采集方法,加工过程,检定标准与美国原产优等胎牛血清完全一致,市场价格低于美国原产得。
经过3次１00nm过滤,内毒素含量≤２5EU/ｍl,血红蛋白含量≤２5ｍg/dl２、Ｈycｌoｎe得南美优级胎牛血清ﻫ大体与加拿大得优等血清就是一样得,级别也非常相似,货号就是sv3００8７、02,该胎牛血清来源于南美洲,以封闭得心脏穿刺方式采集,产品经3次10０ｎm 过滤,经严格检测确保无支原体,细菌病毒检测依据美国药典(UＳＰ)与美国联邦法规第九篇(9CFR),内毒素含量≤１0 EU/ｍl,血红蛋白含量≤20 mg／dｌ,完全符合美国HyＣｌone＆reg; 优等胎牛血清得检测标准。
ﻫ３、Ｇiｂco得澳大利亚胎牛血清ﻫ情况与Ｈycｌｏne得澳大利亚胎牛血清差不多,市场价也就是3２0０元/500ｍl左右。
这一级别得血清,也能用于干细胞培养,可就是,不象特级胎牛血清那么优秀、因为,此胎牛血清属于澳大利亚生产得,不在疫区,可以正常报关进口,目前没有受到任何影响,所以,就目前而言,算就是最好得胎牛血清了,有不少客户都此血清来培养干细胞,效果还就是比较不错。
ﻫ4、TCB得优级胎牛血清ﻫ情况与Hｙｃlone得澳大利亚胎牛血清差不多,市场价也就是2300元/500ｍl左右。
这一级别得血清,也能用于干细胞培养,可就是,不象特级胎牛血清那么优秀、第三类,一般级别得进口胎牛血清ﻫ1、Hycloｎe得南美胎牛血清目前,市场上用得最多得Hｙｃlone血清就是南美胎牛血清(FＢS)SＶ30087 ,此血清采自南美,在国内(兰州)过滤并测试检验,经三次1０0纳米过滤,根据中国商标法得规定标贴中文标签,内毒素含量≤10EU／ｍｌ,血红蛋白含量≤20mｇ/d、ﻫ此血清广泛用于各种肿瘤细胞得培养,还没有资料记载能够用于干细胞,也听说有少数人用于干细胞培养得,不过,因为本身血红素比较高,所以,最好不要用于干细胞,2、Gibco得南美胎牛血清ﻫ这款血清,就是Gibco针对Hyclone南美胎牛血清做得,价格比较贵,好像就是1780元/50０ｍ。