、准备工作1，清洗偏转板，防止盐离子影响电荷加载，电流偏转。

1）用超纯水沾湿医用棉签，擦拭偏转板所有金属物件。

再用干棉签擦干。

2）5ml 注射器吸超纯水，清洗缝隙。

用滤纸先吸水，再用干棉签擦干。

2，鞘液桶加液3, 喷嘴超声，喷嘴放入超纯水中，超声2min。

用滤纸吸干水分，晾干。

二、开机启动1, 启动电脑，密码BDIS,点开软件，无密码2，机箱侧面依次打开总机开关，蓝色、红色激光。

3, 液流启动：Cytometer --- FiuidSetup1 ）气路（透明管）、液路（蓝色管） ,从乙醇桶上拔下,插到鞘液桶2）闭合喷嘴从侧面放入到喷嘴位置,旋转至12 点方向3）取下闭合喷嘴4）将超声过的喷嘴放入喷嘴位置。

4, 喷嘴压力切换：菜单栏中Sort---SortSetup --- 70um （选择当前使用的喷嘴大小）5, 液流调整：点开电脑界面中70um图标栏里的Stream，从打叉状态变为打勾。

查看是否都处于正常状态：1）打开仪器机箱，查看液流是否流到废液槽。

如果偏离，拧开两边的螺丝，左右推动使液流到达槽内，拧好螺丝。

2）查看电脑界面，液流图像是否稳定，如果有黑白灰图片变化，用棉签擦拭偏转板上方3）查看电脑界面，液流是否在中央，如果不是，可以手动调整仪器摄像头，或者重新插好喷嘴。

4）机箱中查看激光束是否完好通过，用干棉签挡住通过位置，如果看到激光射出，则正常。

然后关闭主机箱外盖。

调整液流：通过调整振幅来实现。

1）振幅Ampl,数值调大，使液流断滴在上1/3处，即2滴连续液流。

2）频率Freg ，一般不动。

3）Gap：当喷嘴为70um时，数值一般为7、8、9。

100um时，为10, 、11 、12。

4）当Ampl和Gap都稳定时，把实际值（后面）手动输入到确定值的框内（前面）。

5）点击StreamSpot ，锁死数值，保持液流稳定。

Dropl :实际值和确定值，变化幅度保持在10以内。

Gap：实际值和确定值，变化幅度保持3以内。

此视为稳定液流。

三、手动调补偿：样品：Negative （双阴管），FITC（单阳），PE（单阳）‘SampleFITC,PE 双阳）1，Browser 中：建立文件夹（单击folder 图标）-------- 建立文件（单击experiments图标）,出现CST新窗口，选择keepcurrentcytomotersetting --- 建立样本，单击注射器图标，出现spcimen ---- 点开下面的+号，出现Tube，点成绿色。

以上文件最好都改名，分别右击英文，raname。

2，Inspect 对话框中看参数，Cytometer 中调参数。

在电压Parament中：FSC, SSC选择线性，即lingeage , 即不打勾。

其他对数log ，即打勾。

3，Inspect 中lables ，改标签名称，egCD3-FITC,CD4-PE。

4，上ddH2O，Flowrate ：11。

5，上样品Negtive （双阴），Flowrate 只要在1/5Fred （说明Fred单位为kHZ所以乘以1000除以5）。

画散点图两个，分别选择标识。

图一：横坐标FSC纵坐标SSC图二，横坐标CD4-FITC,纵坐标CD8-PE图一，调节FSC，SSC的电压，在Cytometer 中parameter 里。

使得样品出现在中央位置。

图二，调节FITC，PE的电压，使得散点落在左下侧里。

完成收样后，在图一画门。

在图二右击showpopulation ，点击P1,再右击showpopulati on hierarchy 显示门的关系，再十字象限画门。

6, 上样品FITC单阳管。

调补偿。

在AcquisitionDashboard 中选择nexttube ，在load 样品。

不可选择newtube。

调补偿。

在PE-X%FITC X上调数字，使得散点图落下。

7, 同理，上PE单阳。

如果双阴跑出横纵坐标以外，可以自动或者手动调整负轴。

Automatic 自动,则单击Inspector ,选PotPlot ,在BiexponentialDisplay 中把XAxis，YAxis，打勾，使负值轴显示。

Manual 手动,打勾,调数值。

8, 上双阳。

9, 事后调补偿。

若复制到当前文件夹。

在Browser 的当前tube 中右击Cytometer , 选择copyspectraloverlap , 选择Pastspectraloverlap 在总experiment 。

若复制到其他文件夹。

在Browser 的experiment 在右击DuplicateWithoutData四、自动补偿1, 在Browser 中Newexperiment , 选择keepcurrentsetting 。

在Cytometersettings 中删除参数。

2, 文件栏中experiment ,选compersationsetup ,选creatcompensationcontrols 。

将自动生成各种tube ,点击tube 呈绿色后,自行生成散点图和直方图3, 上样，双阴管。

调整电压FSCSSC电压，在Cytometer 中的Parameter ，使得细胞在中央位置。

上样结束后，设门。

右击图片，Applytocompensationcontrols.调FITC的电压，使得峰值图出现在10八2位置。

调PE的电压，同理。

4，上样，单标FITC，只需load，阳性门移动到阳性峰，不用调节其他。

5，上样，单标FITC，同理。

（上样量如果不够，可以在加样，并record 以后，Append 继续累积。

）6，计算文件栏中，Experiment 中选中Compensationsetup ，选中catulatecompensation, 修改需保存的名称，点击link&save 。

此后所有实验的Specimen 都是和该电压补偿的参数保持一致。

就此补偿结束。

五、检测样本1，新建Specimen.在Normalworksheet中点第一个小图标，切换回实验用的GlobalWorksheet 。

2，Browers 中，点中生成Tube。

在Acquisition 中选nexttube, 右击rename，在record。

3，上样，双阴性negative ，4，上样，双阳性sample。

六、关机1，关液流，在Cytometer 在选Fluidshutdown ，关掉Stream 。

2，鞘液桶的气路（透明管）、液路（蓝色管）插到酒精桶的位置。

液路需要从滤器旁边拆开，先插液路，再插气路。

气路足可以放气。

3，取喷嘴，超声2min。

4，放入封闭喷嘴，等待清洗。

5，取出封闭喷嘴6，Cytometer 中standby 。

7，关仪器开关，激光开关。

关电脑。

细胞分选1，鞘液。

1）在70um对话框，点开voltage调加压。

点testsort 呈花洒状态，测试分选。

反复点opticalfilter 选择性过滤。

调节下面四个电压，其中一三四为0，反复调整二的值，使得液流在两个空白框内。

2，上accudrop 。

1 ）在文件栏中，选择experiment ，选newexperiment ，出现ExperimentAccudropDelay 模式。

逐级点下去，Sepcimen，双击tube ，点sortlayout ，要opensortlayout 对话框。

调节FSC的电压，使得小于50。

2) 点Voltage 加电，opticalfilter 中看百分比。

上样速度flowrate调高使达到2000 个/s 。

3) 点击Sort ，在对话框中选择cancel 。

4) 点击AutoDelay 。

Startrun 。

等待分选左侧框100%数值出现。

退出Exit 。

保存数据3，鞘液。

左右分选位置测试。

1) 空白管放入仪器架上，准备对液流位置。

2) 70um对话框中，分别点击加压、测试、过滤、去挡板。

3) 反复调节两个空白框下的二路和三路电压，时刻查看电压是否能够使仪器上液流打到管子中心，避免到壁上。

4) 调节2rd,3rd,4th 数值，先都归零，再依次调。

排除静电干扰，使光束聚焦。

4，样本。

1) 更换接受样品管。

2) Sort 点OK。

？？？3) 打开实验文件夹，呈现书形。

双击experiment ，在Globalworksheet 中画满，P2,P3.4) 上样本管。

Browser 中箭头绿色，browser 的bar 里点createanewsortlayout选择。