铜绿假单胞菌感染和耐药机制[摘要] 铜绿假单胞菌是医院内感染的重要的致病菌之一，它可导致较高的发病率和病死率，铜绿假单胞菌容易出现耐药性，并且容易表达多种毒性因素，这一切使得现在临床上所用的治疗方法常常无效，本文针对这种状况，首先介绍铜绿假单胞菌在临床上引起的常见的感染和疾病，其次介绍铜绿假单胞菌的耐药性机制，最后提出对抑制铜绿假单胞菌耐药性的药物研究的展望。
[关键词] 铜绿假单胞菌耐药性毒性因素药物铜绿假单胞菌是革兰氏阴性杆菌，是条件致病菌，它对健康的机体几乎不会引起感染，但是对免疫受损的机体可以引起严重的感染，免疫受损的机体包括囊性纤维化患者，癌症病人，艾滋病毒感染者，严重烧伤病人[1]。
由于传统的抗生素治疗，使铜绿假单胞菌对许多抗生素产生了严重的耐药性，它可以产生各种灭活酶或修饰酶, 如内酰胺酶等; 菌体蛋白结构和功能改变逃避抗菌药物作用; 膜屏障与主动排外;形成生物保护膜等[4]，来抵制抗生素的作用。
这也是在临床上很棘手的问题，使铜绿假单胞菌不仅成为难以治疗的病原菌，也使其成为众多研究细菌致病性和耐药性的对象。
首先来了解一下铜绿假单胞菌引起的常见的感染和疾病。
1、铜绿假单胞菌引起的常见的感染和疾病在临床上发现呼吸科和烧伤科铜绿假单胞菌感染率和检出率较高。
1.1铜绿假单胞菌相关性肺炎它包括慢性阻塞性肺疾病( COPD)，医院获得性肺炎（CAP），呼吸机相关性肺炎( V AP)，气管镜相关性肺炎，囊性纤维变性（CF）等。
慢性阻塞性肺疾病( COPD)慢性阻塞性肺疾病( COPD) 是以感染为主要表现的疾病, 由于其呼吸道防御功能下降, 支气管清除能力减弱, 故能引起多种细菌的感染, 铜绿假单胞菌感染是COPD 病人急性加重的主要原因。
铜绿假单胞菌一开始就被认为是引起慢性阻塞性肺疾病( COPD)的重要的致病菌[10]，Laura 的研究证明铜绿假单胞菌引起COPD病人的慢性感染[11]。
医院获得性肺炎（CAP）铜绿假单胞菌在社区获得性肺炎中不常见，但在医院获得性肺炎（CAP）中较常见的病原菌之一[2]。
CAP 是COPD 常见并发症和重要死亡原因之一, 近年来国内关于COPD 患者合并CAP 方面的研究得到广泛关注。
同时由于社会人口的老龄化、免疫损害宿主增加、病原菌变迁和抗菌药物耐药率上升等原因, 其致病菌的组成和耐药特性在不同国家、不同地区之间存在着明显差异, 而且随着时间的推移而不断变迁[6]。
呼吸机相关性肺炎( V AP)机械通气已成为重症监护病房( ICU ) 救治呼吸衰竭患者的重要手段, 随之而来的呼吸机相关性肺炎( V AP) 日益受到人们的重视。
铜绿假单胞菌已成为V AP 的主要致病菌, 其具有多药耐药性, 治疗难度大, 病死率高。
由于铜绿假单胞菌在医院环境中广泛分布, 常见于医务人员的手、病床、桌面、呼吸机管路、各种医用导管及医疗用品的表面等, 使得机械通气患者成为铜绿假单胞菌感染的易感人群。
该菌所致的感染大多发生在免疫功能低下且伴有严重基础疾病的患者, 如高龄、COPD 患者、脑外伤或脑血管意外患者, 较大创伤对自身免疫力的削弱以及气管插管或气管切开、机械通气、留置导尿等侵入性操作, 均使感染的机会大大增加[5]。
1.2烧烫伤后感染烧烫伤患者严重感染已成为影响其健康、甚至导致死亡的重要原因之一，30年来感染一直占据死亡原因的首位[12]，烧伤后的感染是一个很重要的问题，因为一旦感染上医院获得性的多重耐药性细菌，将是一个很麻烦的事情。
在烧伤感染细菌菌种多以革兰阴性杆菌为主, 其中以铜绿假单胞菌的检出率最高。
各地报道显示, 该菌的检出率牢牢占据革兰阴性杆菌的首位[13-14] , 成为烧伤创面感染常见细菌之一。
铜绿假单胞菌适应性很强，它对不少抗生素有天然耐药性，这使得它可以定植在烧伤部位并可以快速增殖，而这种局部的增殖可以导致全身的脓毒血症，而脓毒血症又可导致高的死亡率。
[15]这些疾病在临床上一旦出现非常棘手，因为铜绿假单胞菌适应性很强，它对不少抗生素有天然耐药性和后天获得的多重高度耐药性，临床治疗十分困难,一旦感染,病死率很高。
2.耐药机制铜绿假单胞菌耐药机制相当复杂, 已知的主要有: (1) 青霉素结合蛋白( PBPs) 结构和功能的改变以及与抗菌药物亲和力的下降。
(2) 外膜通透性降低。
(3) β-内酰胺酶的产生。
(4) 氨基糖苷类修饰酶的产生。
(5) 细胞外膜主动外排系统的表达。
另外(6)铜绿假单胞菌生物膜的形成也使其对抗菌药物不敏感[6]。
2.1细胞外膜主动外排系统铜绿假单胞菌外排泵是由相同的操纵子所编码的内膜转运体( 如MexB、MexD、MexF、MexY、MexI 和MexW)和MFP 以及由相同的操纵子或染色体其他区域的基因所编码的OM 蛋白共同形成的一种贯穿内外膜的通道，该通道能够直接将靶物质从细胞质泵至细胞外环境。
铜绿假单胞菌外排系统包括MexAB-OprM 型和MexCD-OprJ 型，主导致菌株获得性的对多种药物耐药的原因是MexAB-OprM 的过度表达。
主动外排系统MexAB-OprM 的高表达对美罗培南的耐药起重要作用，其高表达与调控基因mexR变异有关，MexAB-OprM 高表达的分子机制可能与泵调节基因MexR 的突变以及其他突变型有关[17]，MexAB-OprM 主动外排系统表达水平的增高与PA多药耐药的形成密切相关[18-19]。
2.2β-内酰胺酶的产生,铜绿假单胞菌产生三种β-内酰胺酶，包括超广谱β-内酰胺酶（ESBL),诱导酶（AmpC 酶）, 金属β-内酰胺酶。
其中金属β-内酰胺酶可以水解亚胺培南,导致其耐药,而亚胺培南被认为是治疗铜绿假单胞菌等感染的重要武器，目前发现的获得性金属β-内酰胺酶包括: IMP、VIM、GIM、SPM4 种, 其中以IMP 和VIM 常见, IMP-7 ( GenBank AF318077)其产生菌对美洛培南和亚胺培南高度耐药[24]。
产ESBLs 不易被忽视, 国外报道铜绿假单胞菌产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs ）的检出类型已达150 余种, 其中, 以OXA 型增长最快, OXA-50 在铜绿假单胞菌的表达可降低氨苄西林、替卡西林、拉氧头孢和美洛培南的敏感性[20]。
国内徐卫等报道在铜绿假单胞菌中, ESBLs 的检出率已高达38-23% [21-23]。
有文献报道，铜绿假单胞菌染色体固有携带ampC基因，但基因的表达受诱导剂(抗生素)调节，促使AmpC酶的产生，一旦去除抗生素，大多数情况下产酶水平水逐渐恢复到基线水平[28]。
但当ampC基因自发突变可致稳定的去阻遏表达而产生持续性的高水平酶[29]。
2.3外膜通透性降低OprD2 蛋白形成的特异性孔道, 可以促使碳青霉烯类抗菌药物进入铜绿假单胞菌细胞内部, oprD2 基因的缺少或者不表达会导致碳青霉烯类抗菌药物（除美罗培南外）对铜绿假单胞菌不起作用[25]。
衣美英等[16]测定该院SICU 分离的49 株PA，其结果显示: 对碳青霉烯耐药主要是由外膜蛋白OprD 表达降低或缺失引起，与IMP、VIM 金属酶无关。
邹德胜等[26]通过对26 株耐亚胺培南铜绿假单胞菌进行oprD2 基因的PCR 扩增, 显示其中有20 株为膜孔蛋白oprD2 基因缺失。
这一结果说明oprD2 基因的缺失应该是亚胺培南对铜绿假单胞菌不起作用的主要原因[27] 。
2.3氨基糖苷类修饰酶与16SrRNA 甲基化酶的产生酶修饰是氨基糖苷类抗生素最常见的耐药机制，经酶修饰的抗生素与细菌16SrRNA 上的A 位点的结合力下降，从而导致药物抗菌活性的丧失[31]。
依据其修饰功能的不同可分为 3 类，即氨基糖苷磷酸转移酶( aminoglycoside phosphotransferases，APH) 、氨基糖苷乙酰转移酶( Aminoglycoside acetyltransferases，AAC) 和氨基糖苷类核苷转移酶( aminoglycoside nucleotidyltransferases，ANT) [32]。
铜绿假单胞菌具有编码这3类修饰酶的基因[33]。
16SrRNA 甲基化酶是近年来发现的一种新的由质粒介导的耐药机制，与临床上常见的氨基糖苷类修饰酶不同，氨基糖苷类修饰酶具有底物特异性，因此，细菌同时对多种氨基糖苷类抗生素产生持续耐药比较少见，而甲基化酶修饰的是所有氨基糖苷类共同的作用位点，一旦修饰发生，目前使用的一切氨基糖苷类抗生素都将失去作用，并且耐药菌的MIC 往往高达512 ～1024 mg /L。
这种新的耐药机制的出现，打破了以往的认识，微生物学家们惊呼“前所未有的”危险的氨基糖苷类耐药菌株不久将在全球播散，必须引起临床高度关注。
2002 年，日本学者Yokoyama 等对1 株分离自1997 年的铜绿假单胞菌的研究中，发现其对阿贝卡星（卡那霉素的衍生物）高度耐药，介导铜绿假单胞菌对阿贝卡星高度耐药的是这种新的氨基糖苷类耐药机制——16SrRNA 甲基化酶，( RmtA)，并且该酶的编码基因和超广谱β-内酰胺酶CTX-M-3 编码基因位于同一接合性质粒上[30]。
2.4铜绿假单胞菌生物膜的形成生物被膜是细菌为适应自然环境而形成的，系指细菌吸附于生物材料或机体腔道表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等，将其自身包绕其中形成的膜样物[36]。
铜绿假单胞菌为临床产生细菌生物被膜相关感染最常见的致病菌,铜绿假单胞菌在体内粘膜、各种插管、病房物表等上形成的生物膜,这与铜绿假单胞菌引起的感染, 特别是肺部感染,很难被清除, 常常导致感染的反复发作有很大的关系。
铜绿假单胞菌在湿润环境下, 浮游细菌可吸附于固体的表面, 形成微菌落, 并合成分泌大量胞外多糖基质, 进而微菌落分化为由胞外多糖包裹的成熟生物膜[34]。
粘液型铜绿假单胞菌，其主要成份藻酸盐是形成生物被膜的重要基础，藻酸盐使细菌牢固粘附于肺上皮表面形成生物被膜，一方面可抵御单核—巨噬细胞的吞噬作用，另一方面可抵制抗菌药物的杀灭作用[37]。
而非粘液型的铜绿假单胞菌在渗透压高、氯化钠较多、磷酸盐少的条件下，容易转化为粘液型[38]。
铜绿假单胞菌生物被膜的形成是难治性肺部感染的重要原因，死后肺组织的电镜分析亦显示铜绿假单胞菌在患者的肺部形成微菌落[39]。
3.药物研究3.1抑制铜绿假单胞菌主动外排铜绿假单胞菌广泛耐药的主要原因是主动外排系统，而解决其广泛耐药的重要措施是抑制主动外排．但是许多在体外活性良好的外排泵抑制剂由于安全性、特异性、机制明确性等诸多问题并未能像β-内酰胺酶抑制剂在临床广泛应用．但我们相信通过对各种抑制外排方法的研究，尤其是对基因靶向干预治疗研究的不断深入和发展，可以在不久的将来较好地解决多药外排介导的抗菌药物耐药问题，并取得较为理想的效果。