差
超薄切片技术
• 固定-- 脱水-- 包埋-- 切片--染色 – 固定：要求保持样品的形态结构不发生改变，常用固定剂为戊二 醛和锇酸等，通常在低温下固定。 – 包埋：使样品中各种细微结构在切片过程中都得到均匀良好的支 撑，使切成的超薄切片仍能保持连续完整并且有足够的强度，并 能耐受干燥以及观察时的电子轰击、高温和真空挥发。常用的包 埋剂为环氧树脂。包埋剂多与水不相溶，所以包埋前要经过一系 列脱水处理。 – 切片：厚度通常为40~50nm，常用玻璃刀。 – 染色：用重金属盐进行染色以形成明暗反差。样品中不同成分对 染料有不同亲和性（脂肪：锇酸；蛋白质：铅盐；核酸：醋酸铀）
分辨率
• 分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。 D = 0.61λ/ (n·sinθ) D：分辨率 λ：波长 n：物镜与物体间介质折射率 2θ：物镜镜口角 N.A：即n·sinθ，数值孔径
• 2θ最大值 = 140℃，空气中n = 1，最短的可见光波长λ = 450nm，分辨率D = 292nm，约0.3um
• 原理：使用波长比可见光短得多的电子束作为光源（波长一般小于 0.1nm），用电磁透镜聚焦，电镜镜筒中要求高真空，图象需用荧光屏 来显示或感光胶片作记录。
• 分辨率：0.2nm；放大倍数106倍。 – 人眼分辨率0.2mm；光学显微镜分辨率0.2um，放大倍数1000倍。
• 基本构造 – 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 – 成像系统：物镜、中间镜、投影镜 – 真空系统：用两级真空泵抽气，保持电子枪、镜筒及记录系统内的 高真空。 – 记录系统：用荧光屏显示或感光胶片作记录。
• 荧光： – 自发荧光：通过激发光使物体发出荧光，如叶绿素、维生素A – 诱发荧光：通过诱导剂作用而发出的荧光，如甲醛蒸汽处理诱发细 胞和组织中生物单胺类产生荧光 – 荧光染料染色荧光：丫啶橙对细胞DNA、RNA同时染色后，DNA 呈绿色荧光，RNA呈橙色荧光。
4. 电子显微镜技术 （electron microscopy）
• 冷冻蚀刻技术主要用来观察断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结 构，样品不需包埋、固定，能更好地保持样品的真实结构。
负染色技术
• 负染色：利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷钨 酸钠、醋酸钠等）将生物标本包围起来，增强背景散 射电子的能力以提高反差，在暗的背景下显示标本的 形态结构。主要用于颗粒状标本（细菌、病毒、分离 的细胞器等）的研究。
– 利用一m）和蓝紫光（420nm），经过滤色系统， 作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后， 再通过物镜和目镜（石英玻璃制成）的放大进行观察，这种荧光在 显微镜下很容易辨认，敏感性高，能对细胞的特定物质进行定性、 定位和定量观察。
冷冻蚀刻技术
• 方法 – 冷冻 —快速低温冷冻法
• 将样品在液氮或液氦中迅速冷冻
– 断裂—低温下断裂 – 蚀刻：在真空中冰升华 – 复型
• 用铂、金等金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸的电子反差， 再经碳垂直于断面进行真空喷镀，形成一个连续的碳膜，然后用 消化液把样品本身消化掉，将剩下的碳膜及其构成图形的金属微 粒移到载网上进行电镜观察。
微生物实验技术（一）
一、显微镜技术
• 光学显微镜技术 – 普通光学显微镜技术 – 相差显微镜技术 – 荧光显微镜技术
• 电子显微镜技术
1.普通光学显微镜技术
（light microscopy）
• 结构 – 光学放大系统：物镜（油镜、高倍镜和低倍镜）和 目镜（10×、16×） – 照明系统：光源、反光镜和聚光器 – 机械和支架系统
• 油镜：n = 1.52，D = 0.2um
• 普通光镜的最大分辨率D = 0.2um
2. 相差显微镜技术
（phase-contrast microscopy）
• 相差显微镜与普通显微镜的区别：
– 在物镜后装有一块“相差板”，偏转的光线分别通过相差板的不同区 域，由于相差板上部分区域有吸光物质，使两组光线之间增添了新的 光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。最后这 两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象， 表现出肉眼可见的明暗区别。
二、常用的微生物染色法
• 简单染色法 • 革兰氏染色法 • 负染色法
细菌的观察方法
水浸片（压滴法）：在载玻片中央滴一滴无菌水，再
在其中加入少许菌体，使其均匀分布在无菌水中，盖 上盖玻片，镜检。
悬滴法：把要观察的含菌液体，滴在盖玻片上，然后
把它翻过来，放置在凹孔载玻片上，使液滴悬挂在凹 孔室内。
媒染 碘液
脱色 乙醇
G+ 复染 沙黄
G-
革兰氏染色法的原理
• 通过初染和媒染后，在细菌细胞的膜或原生体上染上 了不溶于水的结晶紫与碘的大分子复合物。G+细菌由 于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧 密，在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔因脱水而明显收缩， 又由于其基本不含类脂，故在用乙醇处理时不会在壁 上溶出缝隙，因此结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其 细胞壁内，呈紫色；G-细菌因其壁薄、肽聚糖含量低 和交联松散，用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔不易收缩， 加上其类脂含量高，乙醇把类脂溶解，在细胞壁上出 现较大缝隙，结晶紫与碘复合物极易被溶出细胞壁， 因此通过乙醇脱色后，细胞呈无色，再经沙黄等染料 复染后呈红色。
• 相差显微镜将光程差或相位差转换为振幅差，即明暗差别。 相差显微镜的样品不需染色，可以观察活细胞及细胞内的某 些细微结构。
– 光线通过不同密度的物质时，其滞留程度也不同，密度大则光的滞留 时间长，密度小则滞留时间短。
3. 荧光显微镜技术
(fluorescence microscopy)
• 仪器：点光源（高压汞灯），滤色系统 • 原理：荧光物质，激发光，发射光
染色法：观察细胞细致形态和主要构造。
→→→→ →→
1.简单染色法
• 简单染色法：只用一种染料处理菌体，适用于一般观察。
涂 干片 燥
干 镜燥 检
固 定
染 色
水 洗
革兰氏染色法
• 革兰氏染色法：由丹麦医生C.Gram于1884年创立，其基本操作分为 初染、媒染、脱色和复染四个步骤。
甲菌 乙菌
初染 结晶紫
电子显微镜与普通光学显微镜的基本区别
光学显微镜
分辨本领 光源
200nm
可见光
(λ:400-700nm)
100nm 紫外光
(λ约200nm)
透镜 玻璃透镜
玻璃透镜
真空 不要求
不要求
成像系统 利用样品对光的吸收形 成明暗反差和颜色变化
电子显微镜
约0.1nm
电子束 (λ:0.01~0.9nm)
电磁透镜
1.33×10-5~ 利用样品对电子的散 1.33×10-3Pa 射和透射形成明暗反