可用于控制流速，流速过高，柱压高
3.进样
样品
进样器 进样阀
流动相
流动相
4.色谱柱 分离的核心部分
(1)色谱柱的分类
类型不同，填料不同
药物分析中，多用硅氧烷型化学键合固定相
极性键合固定相：氨基、氰基键合相，分析极性、中等极 性药物
中等极性键合固定相：醚基键合相，分析中等极性、弱极 性药物
非极性键合固定相：十八烷基键合相，分析非极性、弱极 性药物
试剂的级别：色谱纯；水：重蒸水 （2）滤除不溶性颗粒，以保护泵和色谱柱。
过滤：0.45μm的微孔滤膜（水膜、有机膜） （3）脱气，以保持基线稳定。（ 有气泡，柱压不稳，基线起 伏）
方法：超声或过滤 （4）混合均匀（脱气可达到此目的） （5）pH应符合色谱柱的要求，否则柱床破坏，柱寿命缩短。
2.高压泵（输液泵）
用于气相色谱-质谱联用技术。
三、定量分析方法
系统适用性试验 理论板数，分离度，重复性，拖尾因子 内标法 外标法
四、顶空分析法
生物样品一般不能直接用GC法分析，原因： 1、水分的影响。 2、大多内源性成分挥发性很低，沉结柱头，
损坏色谱柱。 因此一般需萃取，纯化后进样。少数情况下， 被测组分挥发性强，可用顶空分析法。
制备高效液相色谱法
用高效液相色谱法分离制备、纯化样品组分的方法。 制备型色谱柱：实验室 内径20－40mm，长10－30cm 1、分离条件的选择：
固定相：与分析型色谱柱相同，但粒径较大。 流动相：等度洗脱(分段)，溶剂纯度高，易挥发。 流速：与分析柱比，流速大，目的是为了与分析
柱维持相同的保留时间 一般原则：流量之比是柱内径之比的平方。
顶空分析法：（又称液上气相色谱分析法） 不经过萃取直接分析的方法
生物样品中仅用于测定挥发性强或低沸点的药物， 如血中的醇、醛以及某些麻醉气体，或一些挥发性强 的内源性成分。如：尿中的三甲胺。
必要条件：被测组分在测定温度下有足够高的蒸气压 例：血中乙醇浓度测定
方法：样品（血液） 和内标（丙醇）加入 样 品 瓶 ， 60℃ 水 浴 30min 后 ， 用 注 射 器 直接抽取瓶内液面上 的 气 体 5ml ， 迅 速 注 入气相色谱仪，进行 色谱分析。
A、固定波长检测器：只能在一个波长处测定，一 般为254nm。
B、可调波长检测器：190～700nm范围内均可测定， 应用最多。
C、二极管阵列检测器（PDAD）：可在一秒钟内完 成一次从200～800nm波长范围的连续扫描，因此 可同时获得样品的色谱图（用于定量）和每个色谱 组分的光谱图（定性，鉴别色谱峰纯度）。
HPLC
1.液－固吸附色谱（LSC）
2.液－液分配色谱（LLC） 正相LLC（NLLC） 一般RLLC
键 合
反相LLC（RLLC） 离子对色谱（IPC） 相
一般IEC
离子抑制色谱（ISC） 色 谱
3.离子交换色谱（IEC） 离子色谱（IC）
（BPC）
氨基酸分析（AAA）
4.空间排阻色谱（SEC） 凝胶渗透色谱（GPC）
（1）样品沉淀蛋白后进样
样品中加入蛋白沉淀剂（甲醇、乙腈、三氯醋 酸）去蛋白后，将上清液大容量进入预处理柱（短、 粒径小5－10μm），组分保留在预处理柱上，杂质 被冲掉，从而起到净化浓缩的作用。
注意：预处理流动相应选择水或适当浓度有机溶剂 的水溶液，以便使被测组分被保留。且沉淀蛋白后 的上清液需加入适当体积的水稀释，以降低有机溶 剂的浓度，防止被测组分在净化过程中从预处理柱 上被洗脱。
2、上样量的影响
质量超载：脱尾，保留时间
缩短。
体积超载：平头峰，半峰宽
等于柱头样品宽度。
质量体积都超载：平头、脱尾
样品溶液不能过浓，否 则出现局部超载；溶剂强度 不能超过流动相强度，否则 破坏色谱柱内平衡。
3、检测器的选择 非破坏性、线性响应范围宽、灵敏度要求不高。
4、分离样品组分收集 馏分收集器：自动、手动。与检测器的连接管路不
E、使用预柱（保护柱），主要用以吸附流动相和样 品中的杂质，以防分析柱被污染，延长分析柱的寿 命。
F、每次停止使用时，都要清洗柱子。长期保存时， 柱子中要有合适的溶剂（甲醇或乙腈），避免填料 干燥。
5.检测器
（1）紫外检测器：应用最广泛，适用于有紫外吸收 的药物，灵敏度高，对环境温度及流速波动不太敏 感，适用于梯度洗脱。
适用于挥发性低于流动相样品的组分。
灵敏度较低，尤其是对紫外吸收的样品。故 主要用于测定一些没有紫外吸收的物质，如氨基 酸、糖类、磷脂、甾体等。
注意：流动相必须具挥发性，如甲醇－水、乙腈－水。 不能用含无机缓冲液的流动相，若调pH值可用 N
碱焰离子化检测器(AFID) 对氮和磷敏感。
（3）电子捕获检测器(electron capture detecor, ECD)
是一种有选择性的高灵敏度的检测器。主要用于测定含有卤素或 含有-CONH2、-CN、-ONO、-NO2等吸电子基因的有机药物。
（4）质谱检测器(mass spectrometry detector,MSD)
NP－HPLC：流动相极性小于固定相极性
RP－HPLC：流动相极性大于固定相极性
RP－HPLC
固定相极性 低（非极性）
流动相极性
高
组分流 出顺序
极性高的组 分先流出
流动相极 性增加时
保留时 间增加
NP－HPLC
高
低
极性低的组 分先流出
保留时 间缩短
RP－HPLC（体内药分中应用广泛）
最常用的固定相：十八烷基硅烷键合相（ODS或C18）
第六章 色谱分析法
内容
TLC GC HPLC
第一节 薄层色谱法
定性
常作为监测手段
定量
薄层扫描
制备薄层色谱
制备代谢产物 常用
第二节 气相色谱法
一、概述
优点：具有分离和分析两种功能，选择性好、 灵敏度高、用样量少、分析速度快和应 用范围广。
适用：生物样品中具有一定挥发性和热稳定性 的药物及其代谢物的分离测定。 （可衍生化）
（2）可能具有不同的药理和毒理作用，甚至产生药 效拮抗，也可能其中一个对映体导致药物的不良 反应。例：沙利度胺。
2.HPLC分离手性药物的方法
（ 1 ）间接法：柱前衍生化法
定义：是药物对映体在用HPLC分离前，先与具有高光学纯 度的手性衍生化试剂（CDR）反应，在药物对映体中引入另 一个 手性中心，形成非对映异构体，再以常规HPLC法进行 测定。
最常用的流动相组成： 甲醇－水 、乙腈－水。四氢呋喃、有机酸、
缓冲盐。 优点： 1.可将含水体液样品直接进样或只经简单去
蛋白处理后进样，简化操作。尤其适用于测 定含有极性药物或代谢物的体液样品。
2.体液中内源性杂质多数为极性大的化合物， 往往先于药物流出色谱柱，色谱图上这些杂 质峰出峰较早，减少了对药物峰的干扰，且 有利于及时再进样。
5.亲和色谱（AC）
凝胶过滤色谱（GFC）
胶束色谱（MC） 6.假相色谱法（PPC） 环糊精色谱（CDC）
7.手性色谱法（CC）
8.毛细管电泳法（CE）
液－液分配色谱
利用样品组分在两种不相溶的液体（流动相和 涂渍在载体上的固定相）间的溶解度或分配系数的 差异来进行分离。
按照固定相和流动相的极性差别，液－液分 配色谱分为正相色谱（NP－HPLC）和反相色谱 （RP－HPLC）。
（3）被测样品组分富集提高了检测灵敏度
（4）精密度高
(五)手性药物的高效液相色谱法
1.概述
对映异构体：空间结构不能重叠，互为镜像 关系的立体异构体。相应的药物称为手性药物。
为什么必须对手性药物进行研究：
（1）实际上是不同的化合物，它们与体内的大分子 的不同立体结构结合，可产生不同的吸收、分布、 代谢和排泄过程，从而导致药物动力学参数的变 化。
二、仪器简介
进样器
检测器
载气
色谱柱
记录装置
1.载气（流动相）：
常用高纯氮，其他：氦气、氢气、氩气。
2.进样：
1）气体进样、液体进样 2）进样室温度一般等于或高于柱温，以便注入的样品能瞬间挥发。
3.色谱柱：
由柱管和管内的固定相组成。柱管材料通常用不锈钢或玻璃组成。 生物样品分析中通常采用玻璃柱。原因：（1）近于惰性，不会引起 被测组分热催化分解。（2）还可先经硅烷化处理后再装填固定相，能 降低管壁对药物的吸附。 常用一般填充柱和毛细管柱两类。毛细管柱又分为填充毛细管柱和开口 毛细管柱。
简单除蛋白后进样：血清、血浆。 蛋白沉淀剂：甲醇、乙腈、三氯醋酸等。
缺点：使样品稀释，适用于浓度大的生物样品。 适用于：药物或代谢物极性很大，难于用有机溶
剂提取时。
（二）柱切换技术 柱切换技术是指用阀来改变流动相走向及流
动相系统，使洗脱液在特定的时间内从预处理柱 切换到分析柱上的一种技术。
1、柱切换高效液相色谱法在体内药物分析中的应用
由于直接测定的 是与液体样品平衡的 气体，因此，又称为 液上气相色谱分析。
内标
五、衍生化方法
制备衍生化的目的： ①增加被测组分的热稳定性； ②增加被测组分的挥发性； ③减少被测组分在样品制备过程中因吸附性强导致的 损失； ④改善组分的层析行为，即制备成衍生物之后易于同 其他组分分开； ⑤增加被测组分对有关检测器的灵敏度和选择性。
（3）全血或组织匀浆直接进样
关键是预处理柱必须使用粗粒径的固相填料 （50－90μm）和较大孔径的柱滤板，以便使血细 胞易于通过预处理柱。
（4）其他 在线透析、在线衍生化等
2、柱切换HPLC的主要优点 （1）使液－固提取技术与HPLC分析技术结
合，具有样品制备和样品测定双重功能。 （2）样品前处理简单且自动化
4.常用检测器
（1）氢火焰离子化检测器： （hydrogen flame ionization detector, FID ）