高等真菌蛋白--从森林走到应用Jana Erjavec1, Janko Kos2, Maja Ravnikar1, Tanja Dreo1 and Jerica Saboticˇ 21生物技术与系统生物学研究所，Vecˇna pot111，SI-1000Ljubljana, Slovenia2生物技术，Jozˇef Stefan研究所，Jamova 39, Sl-1000 Ljubljana, Slovenia近年，蘑菇迅速被公认为一种很有前途的新颖蛋白质的来源。

现今已经从中分离出多种不同功能的蛋白，包括外源凝集素、木质纤维素酶、蛋白酶抑制剂和疏水蛋白。

这些蛋白为医疗和生物技术问题提供了解决方案，如在微生物耐药性方面、作物低产方面和再生能源的利用方面。

尽管特殊功能蛋白相对来说还未完全开发，但真菌蛋白的大规模生产和工业化应用证明了它们在生物技术方面应用的潜能，也证明了高等真菌的价值。

本文最先提供了已知真菌蛋白的综述，阐述了如何获得新型生物活性蛋白的过程，也概述了这些蛋白在生物技术、医学、农业方面当前和预期的应用。

高等菌类中的生物活性物（参照术语表）真菌（酵母、霉菌、蘑菇）具有多样化的形态、生理生态特性和不同的生活方式，包括寄生虫、腐生生物（降解死的有机体，主要是植物）和共生生物体（形成地衣和菌根）。

这些特殊的中间相互作用，以及对资源的竞争、对病害和环境中掠夺性生物的防御，均由于其能产生广泛的生物活性物质。

据估计，蘑菇由140000种真菌（也被称作高等菌类）组成，属子囊菌门、担子菌属[1]。

其中，约2000种种类可以食用，但只有200种在传统上被广泛应用于食物、药物和其他方面。

即仅10%的蘑菇种类被人们认识，这无疑使其成为一个巨大的还未开发的潜在有用物质。

在人类和兽类医学上，对微生物的耐药性和许多未治愈的疾病，都需要探寻新的方法。

也需要更为有效的自然资源利用率，包括高的作物产量，环境友好型植物保护和再生能源的利用。

现已证明真菌在许多医学和生物技术应用方面的作用，是因为它们具有独特的代谢过程，且能降解酶和次生代谢物[4]。

260种商业化酶中，虽然只有5种来源于高等菌类，但是大约60%来源于真菌[5]。

高等菌类一直被忽视作为生物活性物质的来源，传统知识在医药和生物技术方面的实施缓慢，这都是从过去几十年中的调查中得到的。

从高等真菌中分离出的具有生物学活性的物质可以分为：（i）次生代谢物（酸,萜类化合物,多酚、倍半萜烯、生物碱、内酯、固醇、金属螯合剂、核苷酸类似物和维生素）；（ii）（甘氨酸）蛋白；(iii）高分子量多糖，包括云芝糖肽和蛋白聚糖。

多糖，特别是β-葡聚糖----蘑菇中研究最广泛的一种生物活性分子，具有抗肿瘤和免疫调节功能，并且已经用于临床治疗[2,3]。

在蘑菇中已经发现了具有多样性和未知生物活性的蛋白，它们可用于生物技术过程和新药物的开发（包括木质纤维素降解酶、凝集素、蛋白酶、蛋白酶抑制剂,核糖体失活蛋白和疏水蛋白）。

蘑菇中的蛋白最大的优点是其独特性，因为它们不同于微生物、动物和植物蛋白。

此外，虽然不是从嗜极微生物体得到，但蘑菇中的许多蛋白表现出很好的热稳性和稳定的PH值[6-10]。

蘑菇中另一个优势生物活性成分是它们具有识别性物质，所以能正确地选择原始材料。

人类消费和应用的实际安全性，是鉴于它们对人类健康产生影响的长期实验。

本文主要介绍了高等菌类中具有生物学活性的蛋白，包括从蘑菇中分离出的所有功能蛋白组。

介绍了新的生物学活性蛋白的获取步骤，从蛋白质的筛查和纯化到其特性。

还介绍了已经被识别和评估的不同蛋白，在当今乃至未来医学和农学方面生物技术领域的应用。

这些各种各样的蛋白和它们的应用强烈表明了蘑菇中的众多潜能蛋白为普通蛋白和特殊蛋白提供了新来源。

蘑菇中的多肽和蛋白虽然蘑菇是不同蛋白的丰富来源，但已经被确定的蛋白却很少，关于其特性就更少了。

蘑菇中的水提取物和蛋白具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤和免疫调节,以及杀虫作用（表1）。

将具有蘑菇特征的几组蛋白根据其化学活性列在表2中。

这些蛋白的可变性和有限表征水平揭示了高等真菌作为新型蛋白质来源的巨大潜力。

高等真菌中中研究得最清楚的一组蛋白是木质纤维素降解酶，由氧化酶和水解酶结合而成，包括漆酶、氧化物酶和一些其他的氧化酶类、（半）纤维素酶和不同的糖苷酶[11,12]。

其他著名的的氧化还原酶是络氨酸酶，是黑色素中合成的关键酶，研究最多的是由双孢菇产生的，它参与收货后褐变[13]。

蘑菇中的蛋白已经商业化的一个例子是植酸酶，它是一种饲料添加剂，能提高单胃动物对磷和矿物质的吸收[14]。

对于蘑菇中的蛋白酶研究相对较少，其研究主要旨在识别在工业和医学上有潜在应用的蛋白酶。

野生蘑菇蛋白的水解潜力评估揭示了多种蛋白的水解活性，催化类蛋白分布广泛。

但是，许多此类蛋白显示独特的性状，从而独自成为担子菌[15]。

这使它们成为一个巨大的还未开发的蛋白，也是蛋白酶抑制剂的良好来源。

后者的信息更为有限[16]，仅有两种良好特性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂在结构上不同于植物或动物蛋白抑制酶[6,9]。

两种丝氨酸蛋白抑制剂已经被定性了，这些前肽与相应的平菇蛋白中来源相同[17]，并且具有特殊胰岛素抑制剂的β-折叠[18,19]。

现今，高等真菌里面还没有定性任何天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂[20]。

凝集素是蘑菇中另一个被广泛研究的蛋白。

现已分离出许多种凝集素，其特点是具有特殊的分子和生理特征，包括结构的多样性，糖基化和碳水化合物的特异性。

蘑菇凝集素[10]，其3D结构和治疗潜在性已经被测定。

其中一类，真菌免疫调节蛋白（FIPs），在医药和治疗的潜力上引起极大的关注[22]。

另一些高等真菌中的具有药用潜力的蛋白包括核糖核酸酶（RNases），被称为核糖核酸酶中的一个临床有趣组[23]。

此外，核糖体失活蛋白（RIPs）的毒性研究被用于癌症和抗病毒治疗[24]。

这些简单蛋白或多肽已被证实了其治疗属性，也已调查了其抗真菌、抗病毒、免疫调节和抗癌活性[25]。

少数高等真菌的成孔蛋白已被定性，属于作为毒素和形成不受监管膜孔的类溶素蛋白[26]。

现已经从小平菇中分离出来两种生物素约束蛋白，其生物素约束蛋白明显高于起来来源中的蛋白质[27]。

疏水蛋白是真菌中另一个独特的蛋白，是在分离菌褶Schizophyllum commune (Sc3)中第一个被发现的[28]。

它们是小型两性分子蛋白质，在单分子吸附层的亲水-疏水表面自我组装，转换表面的疏水性，这使它们具有生物多样性和医药应用的潜能[28,29]。

一些预期的应用程序，例如一些大型表面的防污准备工作（如窗户、汽车、船）、医药和化妆品行业乳剂的稳定性、低脂食物的生产，都需要大量的疏水蛋白[29,30]。

获取新型生物活性蛋白的方法靶细胞的识别蘑菇品种是经过筛选而找到的具有选择性活性的最佳来源（表1）。

具独特功能的蛋白质随后要在分子水平上进行纯化和定性（图Ⅰ）。

纯化鉴定蘑菇提取物（见表1）包含复杂的蛋白质混合物和一些其他大分子，以及一些低分子物质。

提取物中通常有多个活性物质，因此，几个纯化步骤需要对目标活性蛋白和蛋白质中复杂纯形式进行分离。

大多蛋白质纯化方法包括色谱方法与透析相结合，超滤作用于超速离心结合。

蛋白质活性可在纯化过程中被检测出来（图Ⅰ）。

纯化后的蛋白质氨基酸序列与数据库中的蛋白质序列进行测定与比较。

如果前人对此蛋白没有做出任何描述，那么我们将需要执行一个完整的性状描述流程，包括测定其分子量、等电点、翻译后修饰、3D结构、生物活性细节特征。

这些特性描述在重组蛋白上经常执行，特别是当材料来源受限。

重组蛋白的生产天然菌丝中生产的蛋白水平很低，无法满足商业需求。

所以优化重组蛋白的表达技术至关重要，特别是在生物制药领域[5,29,31]。

重组蛋白质的生产还有许多其他优势，包括其相对简单的纯化过程，高产和选择生产改良蛋白质。

细菌表达系统是最常用的方法，虽然在特殊的大肠杆菌中可表达真菌蛋白，但酵母和丝状真菌也可能是有用的替代方案（表2）。

糖基化和治疗性蛋白质的异源表达，及其他表达系统，包括昆虫和哺乳动物细胞系或植物系统，均是有利的[31-34]。

在生物技术中的应用木质腐烂担子菌具有在木质纤维素生物质上生长的特殊能力是由于其含有各种各样特殊的酶（表2），这些酶能使植物的生物成分（如木质素、纤维素、半纤维素）有效退化，甚至矿化[11,12,35,36]。

在过去的10年里，研究者们投入了巨大的努力来研究和开发利用这种能力。

一个典型的例子是食用固态发酵，利用可生物降解产品、农林业中的浪费和残留物、或工业和城市垃圾，来作为底物生产蘑菇食品或动物饲料，也可用来生产酶、其他蛋白和药用化合物[]37-39]。

另一个广泛研究的领域是蘑菇及其产酶关于可再生能源产品的利用（表3）。

工业用酶当前，残留和副产品对工业生产极为重要，其中有一个关于在固体废物上栽培蘑菇上产生附加价值的例子，即白腐真菌漆酶引起了纸浆造纸业的重视，它为纸浆的脱木质素化和漂白开发出一套环境友好型技术[12,35]。

天然菌丝中产生的漆酶产品在经济上不具备可行性，并也可能也无法承受严峻的工业生产化过程，所以需要不断研究开发更加稳定的酶和能应用于工业过程中的异源表达系统[7,40]。

漂白过程，树脂控制和纸张涂料，对于真菌酶（木聚糖酶、酯酶和淀粉酶）而言具有商业有效性，同时也能够从高等真菌酶的多样性中获利[5,41]。

多种氧化还原酶已经被用于工业废水和受污染土壤的修复。

高等真菌及其酶能对外源化合物进行修改、降解甚至矿化，包括多环芳烃（PAHs），芳香族含盐化合物与芳香族硝基化合物的混合物[如氯酚、多氯联苯（PCBs）、TNT]，除虫剂和除草剂（如莠去津），内分泌干扰物（如防污剂三丁基锡，塑料软化剂双酚A），药物（如抗生素类），合成染料和脂肪族污染物（如氰化物）和汽油添加剂甲基叔丁基醚（MTBE）[35,42-44]。

酶在生物修复过程中，其有益性质也被用于化学和制药业（如生物催化剂）上的开发。

各种水解酶也被用于有机体，包括腈水解酶、酯酶、酰胺酶、蛋白酶和脂肪酶，然而，还没有一个是从高等真菌中得到的[5]。

已发现许多蘑菇衍生物氧化还原酶在生物合成上的应用，包括漆酶、氧化素酶和络氨酸酶[45、46]。

络氨酸酶还具有将单酚转换成联苯酚的能力，这已被应用于食品添加剂或药品中抗氧化剂的生产。

此外，曲霉中的真菌络氨酸酶被用于从L-DOPA到L-tyrosine的生产，能治疗早期帕金森病和心肌疾病。

从高等菌株中得到的络氨酸酶被认为是通过酶交联产生，例如，能用于组织工程的蛋白质多糖水凝胶、粘合剂、给药基质和皮肤替代品[13,47]。

高等真菌酶在化妆品行业有很大的潜能，例如，漆酶和氧化酵酶在染化和皮肤亮化上的功效。