福建农业大学学报29(4):421-428,2000Journal of Fujian A griculturalU n iversity文章编号:1006278172(2000)0420421208反义RNA技术控制果实成熟的研究进展宋　刚,林顺权,吕柳新,马　英(福建农林大学园艺系,福建福州350002)摘要:简要回顾反义RNA技术的产生与发展;并在介绍果实成熟的生理学和分子生物学的基础上,着重综述利用反义RNA技术控制果实成熟,包括控制乙烯产生、细胞壁降解、色素生物合成等3个方面的国内外研究进展,并对今后的研究方向进行了初步探讨.关键词:反义RNA技术;果实成熟;乙烯;12氨基环丙烷21羧酸;细胞壁降解中图分类号:S667.2 文献标识码:AAdvances i n apply i n g an tisen se RNA technology to con troll i n g fruit ma tura ti on SON G Gang,L I N Shun2quan,LU L iu2x in,M A Y ing(D epartm en t of Ho rticulture,Fujian A griculture and Fo restry U n iversity,Fuzhou,Fujian350002,Ch ina)Abstract:T he e m ergence and devel opm en t of an tisen se RNA techno l ogy are briefly revie w ed.O n the base of brief in truducti on of physi o l ogy and mo lecular bi o l ogy in fruit m aturati on,advances in con tro lling fruit m atura2 ti on,including con tro lling cell w all decompo sability,ethylene and p igm en t bi o syn thesis w ith an tisen se RNA techno l ogy at hom e and abroad are dealt w ith in details,m eanw h ile,the p ro s pects are p reli m inarily discussed. Key words:an tisen se RNA techno l ogy;fruit m aturati on;ethylene;12am inocycl op ropane212carboxylate;cell w all decompo sability20世纪80年代以来,植物基因工程发展日新月异,并相继取得一系列重大成果.1994年5月21日Calgene Inc公司的F lavr SavrTM的番茄成为获准在美国出售的第1种遗传工程完整食品,标志着利用反义技术方法控制果实的成熟已进入产业化阶段,同时也极大推动了反义技术的进一步完善.应用基因工程将外源基因导入细胞,特别是利用反义RNA技术有针对性地控制细胞内某种特异基因的表达及蛋白质合成,定向调控果实的成熟,展现出广阔的应用前景.本文结合作者在应用反义RNA技术把12氨基环丙烷21羧酸(A CC)氧化酶基因和A CC合成酶基因反义转化枇杷、木奈等方面的探索,综述反义RNA技术的产生与发展及其在果实成熟中应用的国内外研究进展.1　反义RNA技术的产生与发展反义技术(an tisen se2techno l ogy)是根据碱基互补原理,利用人工或生物合成特异互补的DNA或RNA片段(或其修饰产物)抑制或封闭基因表达的技术,包括反义寡核苷酸技术、反义RNA技术和核酶(ribozym e)技术等[1,2].RNA具有调节基因表达的功能[1],Si m on s et al[3]进一步证实反义RNA在大肠杆菌质粒复制中具有识别和调节的功能.由此反义RNA技术研究得到重视,但开始的研究多集中于原核生物.直到真核生物自然存在反义系统的发现,特别是Izan t et al[4,5]首次证实人工构建的反义寡核苷酸在真核生物中具生物学效应以来,反义技收稿日期:2000-05-30基金项目:国家教育部骨干教师资助项目.作者简介:宋刚(1973-),男.研究方向:果树生物技术.术在真核生物中的研究才得以迅速发展.随其研究而发展形成的反义技术,提供了一种更为直接有效的人为控制基因表达的方法,而倍受生物学界关注.虽然其机理仍在探讨之中,但利用反义RNA 技术调控细胞内某些基因的表达来定向控制某些生物性状,已有不少成功报道.反义转基因番茄的商品化生产是一个典型例子.现已发现反义RNA 是原核生物中广泛存在的一种调节因子,对转座子活性、质粒复制、细菌或噬菌体的发育过程起调节作用.微注射的反义RNA 、天然的或构建反义基因转录物均能专一性地起抑制作用.因此,反义RNA 技术已成为反义技术研究的主流,已渗透到反向遗传学的各个领域,诸如抗病因子、反向筛选标记基因、农艺品质改良、次生代谢途径的调控等研究.一般认为,反义RNA 与靶RNA 具有特异互补性,通过碱基配对结合的方式在复制、转录、翻译等过程中起负调控作用,详细机理还不清楚[6,7].2　果实成熟的生理学和分子生物学采用反义RNA 技术控制果实成熟的研究,依赖于果实成熟生理和分子生物学知识的积累和突破性进展.果实成熟是指果实生长发育停止后发生的一系列生理生化变化的综合过程,其结果是果实形成典型的外观和食用品质,如成分、色泽、质地或其它感官属性发生变化[8].根据果实在成熟期间有无呼吸高峰区,可以分为跃变型和非跃变型2种类型.跃变型果实在成熟期间出现明显的呼吸高峰,即果实呼吸强度略有降低,然后突然跃迁升高,最后又突然下降,经过此呼吸转折的果实即进入成熟;而非跃变型果实无此呼吸高峰.跃变型果实的典型代表有番茄、香蕉、西瓜、苹果、桃、杏、枇杷、木奈等,非跃变型果实的典型代表有柑橘、葡萄、甜樱桃、草莓、菠萝等.早在1934年Gane 就证明果实本身能生成乙烯(C 2H 4),同时提出了C 2H 4是成熟激素的概念,随后,C 2H 4的生成和作用一直是果实成熟研究中的一个重要内容[8].呼吸跃变与果实内C 2H 4的释放具有密切关系,内源C 2H 4生成超过某阈值,是果实发生跃变的前提,此值大约为0.1-1.0m g ・kg -1[7].果实跃变的基础是C 2H 4的诱导,而呼吸现象以及其它相继出现的如RNA 和蛋白质的合成增多、细胞透性变化等都是次生的.跃变型果实在成熟时发生一系列急速的成分变化,包括贮藏的多糖水解、细胞壁构成物(如果胶)的水解、有机酸变化、香气增加、C 2H 4生成量上升、涩味消失和色泽变化等.这一系列成分上的变化导致了相应果实组织崩溃,硬度下降.而多数非跃变型果实成熟过程缓慢,上述各种变化都是渐进的,不像跃变型果实那么急速.因此,在果实成熟时,跃变型果实与非跃变型果实的生理变化有明显区别.根据果实受丙烯处理时其C 2H 4生成反应的不同,通常认为C 2H 4合成具有2个调节系统.系统 存在于非跃变型果实和未成熟的跃变型果实中,负责调节基础水平的C 2H 4合成和创伤诱导的C 2H 4合成,不能自我催化;系统 负责跃变型果实成熟时C 2H 4的自我催化合成.A da m s et al [9]首次发现A CC 是C 2H 4生物合成的直接前体.Yang et al [10]确定了植物体内C 2H 4生物合成途径,提出C 2H 4的生成是以甲硫氨酸为底物,经S 2腺苷甲硫氨酸(SAM )合成酶、A CC 合成酶催化转化成A CC ,此一限速反应步骤由A CC 合成酶催化完成,A CC 再由A CC 氧化酶催化转化成C 2H 4.C 2H 4合成这一途径,随后又被许多学者证实[11].因此,A CC 氧化酶和A CC 合成酶是C 2H 4合成途径中的2个关键酶.・224・福建农业大学学报　2000年第29卷事实上,在果实成熟过程中,C 2H 4是与一系列成熟特异基因协同表达的;与色素生物合成和细胞壁代谢相关酶的mRNA s 水平降低;而编码正常细胞代谢所必需酶的mRNA s 水平可能维持不变[12].随着分子生物学的飞速发展,分离成熟相关基因已有许多成熟的方法.很多与成熟相关的非同源TOM 系列克隆已被鉴定,这些基因的mRNA s 在成熟果实中含量很低或没有,当果实成熟时含量剧增,很多TOM 同源基因在染色体上的位置已经确定.事实充分证明,果实成熟是分化基因表达的结果,果实的成熟受基因调控[13].目前,已发现与果实成熟相关的酶和蛋白已有30多种.果实成熟过程中mRNA 和蛋白质合成的变化及与成熟相关mR 2NA 的c DNA 克隆与鉴定,在金勇丰等[12]的综述中得到了详尽阐述.果实成熟的分子生物学研究,不仅对揭示果实成熟的生理机制具有重要理论意义,而且为在实践中人为调控这个过程以获得贮藏性好、品质优良的品种奠定了基础.3　应用反义RNA 技术控制果实成熟番茄、香蕉、苹果、葡萄、草莓、枇杷、木奈、菠萝等在贮藏和运输过程中,由于果实熟化过程迅速难以控制,常常导致过熟、腐烂,从而造成了巨大的经济损失.通过低温、气调或使用保鲜剂等方法在一定程度上延长了果实的贮藏期,在目前的果品生产中起到一定作用.但是,由于其阻止成熟的效果难以令人满意,加之成本太高,储存规模难以扩大等缺点而使其难以被普遍采用.因此,通过基因工程培育耐贮藏的新品种,对促进果品产业健康发展,满足国内外消费者的需求具有极大必要性.由于在过去几年里,对果实成熟的分子生物学进行了广泛深入研究,目前已经能够通过基因工程技术来控制果实成熟.美国Calgene Inc 公司的F lavr SavrTM 的番茄和华中农业大学培育出的“华番1号”番茄的商品化生产[14],标志着利用基因工程方法控制果实成熟已进入产业化阶段,同样也是显示植物分子生物学应用潜力的很好例证.目前,国内外应用反义RNA 技术控制果实成熟采用的技术路线概括起来主要有3条,有的已进入实用化阶段,有的尚处于研究阶段,现分别加以综述.3.1　抑制C 2H 4合成延缓果实成熟的基因工程3.1.1　A CC 合成酶反义基因途径　A CC 合成酶是一种以磷酸吡哆醛为辅基的酶,对S 2腺苷甲硫氨酸具有立体专一性,是C 2H 4合成途径中的关键酶之一.目前已从许多植物如番茄[15,16]、苹果[17]、笋瓜[18,19]、小西葫芦[20,21]等分离到A CC 合成酶基因克隆.研究发现该基因属于多基因家族,在这一家族中不同成员受不同因子诱导,但不同来源或同一来源的基因家族不同成员在序列上均存在8个保守区[22],并且与氨基转移酶基因家族具有相当的同源性,但内含子的数目并不保守[23].如目前已鉴定的2个A CC 合成酶基因(L E 2A CC 2和L E 2A CC 4)的表达都与成熟过程有关,而创伤过程只引起L E 2A CC 2的mRNA 水平增高.这2种A CC 合成酶氨基酸的同源性为69%,其c DNA 核苷酸同源性为71%.将既与成熟有关又对创伤过程有关的L E 2A CC 2基因反向插入植物表达载体中转化番茄,转基因番茄果实的C 2H 4合成降低了99.5%,果实在自然条件下不能成熟,这一结果表明L E 2A CC 2的反义RNA 抑制了A CC 合成酶的表达.当用外源C 2H 4处理时,这种抑制过程可以逆转,而且外源C 2H 4催熟的果实与自然成熟的果实相比,其色、香、味以及抗压性等无明显差异.这种反义转基因番茄具有明显的经济・324・第4期 宋刚等:反义RNA 技术控制果实成熟的研究进展价值,为此,美国农业部于1997年许可在22种蔬菜、果树和7种花卉植物上利用这一基因[6].由于来源不同植物内A CC 合成酶基因核苷酸序列上的差异,番茄来源A CC 合成酶的反义基因是否能在其它植物内起作用,目前尚未得出结论.另一方面,对其他植物来源的A CC 合成酶基因的克隆与鉴定已取得很大进展[13,23],但在转基因植物中的表达,大多也仍处于研究中.3.1.2　A CC 氧化酶反义基因途径　A CC 氧化酶也称C 2H 4形成酶(EFE ),也是C 2H 4生成的关键酶之一,直接催化A CC 氧化成C 2H4.可能由于A CC 氧化酶具有对细胞结构完整性的依赖,较长一段时间内对A CC 氧化酶的分离一直未能成功,直到发现由A CC 氧化酶基因pTOM 13的核苷酸序列,推导出氨基酸序列中具有烷酮232羟化酶的同源序列,才用提取该酶的类似方法首次从甜瓜中分离到有活性的A CC 氧化酶[24].现在也已从鳄梨、苹果、香蕉中分离到了有活性的A CC 氧化酶[23].A CC 氧化酶可能是单体,相对分子质量为40×103左右[25].现已证明A CC 氧化酶也存在同工酶,其编码基因构成多基因家族.A CC 氧化酶基因pTOM 13最早从番茄c DNA 文库中克隆出来[26],在此基础上陆续又在番茄[27,28]、苹果[29,30]、豌豆[31]、香石竹[32]、猕猴桃[33,34]、桃[35,36]、鳄梨[37]、荔枝[38]等植物中克隆到A CC 氧化酶基因.H a m ilton et al [39]采用反义RNA 技术抑制转基因番茄果实中A CC 氧化酶活性,实现了对C 2H 4生成和果实成熟的控制,这是世界上首次获得减少C 2H 4生成的转基因植株.随后在桃叶片、果实及受伤情况下,研究A CC 氧化酶基因pch 313RNA 水平和C 2H 4释放量时,发现A CC 氧化酶基因在不同品种的不同组织器官、成熟果实和受伤组织中表达水平有所不同[35],可能与A CC 氧化酶的表达受多基因家族调控有关.至今采用同一技术也获得了减少C 2H 4生成的反义A CC 氧化酶转基因康乃馨、芥菜、甜瓜等植株.叶志彪等[40]也获得了反义A CC 氧化酶转基因番茄,在常温条件下可贮藏88d ,显著长于原亲本,并保持原亲本的果实硬度和颜色等优良品质,表现出一定的开发和应用价值.3.2　抑制细胞壁降解延缓果实成熟的基因工程3.2.1　多聚半乳糖醛酸酶(PG )反义基因途径　果实成熟过程中发生最显著的变化就是果实的软化,而果实软化在细胞壁中发生最显著的变化是果胶物质的降解.大量试验证明,果实软化进程与PG 活性增高一致;在体外实验中,PG 能直接水解从未成熟果实分离得到的细胞壁材料;未成熟果实的果皮组织用PG 酶液处理时其超微结构变化与成熟果实一样;果实不能正常成熟和软化的突变体中PG 活性很低[8].因此,PG 被认为参与果胶的降解.长期以来,研究果实软化时的生理生化大都是以番茄为材料进行的.而反义RNA 技术的应用,为PG 在果实成熟和软化过程中的作用提供了最直接证据.第1个分离、鉴定与果实成熟有关c DNA 克隆所编码的蛋白就是PG 酶[41].转PG 反义基因植物的PG mRNA 水平PG 活性在果实成熟各个阶段都降低,果实中果胶的降解受到抑制,而果实成熟的其它方面,如C 2H 4的合成和八氢番茄红素的合成量不变,以及转化酶、果胶酯酶等的活性未受到任何影响,果实仍然正常成熟,并没有象预期那样推迟软化或减少软化程度[42,43].也有一些报道的结果相反[44,45].不管怎样,PG 对果胶降解固然十分重要,但肯定不是果实软化的主要因素.因此,PG 酶在成熟果实中的功能比起初的认识更为微妙[13].尽管导入反义PG 基因的果实软化过程与对照一样,但转基因果实的加工性能有所改善,更抗裂和机械损伤,更能抵抗继发性真菌的感染,可能与PG 活性下降而导致果胶降解受到抑制有关.值得一提的是,除反义RNA 技术・424・福建农业大学学报　2000年第29卷可降低PG 活性外,正义PG 基因的c DNA 转化得到的番茄植株也表现出PG 活性不同程度的下降,下降范围相当于未转化对照植株酶活力的77%到1%不等.而且转基因植株中PG 蛋白含量与PG 基因mRNA 含量相应降低[46],洪孟民[47]认为可能由于基因间同源序列的存在而引起的共抑制效应.3.2.2　果胶(甲)酯酶(PE )反义基因途径　大量的生理生化实验证明,PE 在绿果中就已存在,在成熟过程中mRNA 水平降低,而PE 酶变化很小.因此,在许多器官和组织中包括成熟的果实中都可检测到PE 酶活性.PE 能从细胞壁的果胶中去除甲基基团,从而加速了细胞壁降解.R ay et al [48]构建了番茄PE 的c DNA 文库,并构建35s 启动子控制下的反义基因.转基因番茄中该反义基因的表达大大降低了PE 酶活性,但对叶片或根部酶活性没有抑制作用.进一步发现低PE 酶活性的果实与对照相比其分子量较大,甲酯化程度提高,细胞壁总的和螯合的可溶性多糖醛酸苷降低,此外果实中可溶性固形物含量也较高.但是对果实成熟过程和番茄红素的堆积并没有影响.研究证明PE 是个多基因家族,导入单一PE 反义基因并不能导致果实中所有PE 的mRNA s 水平降低.有人通过低PG 和低PE 株系杂交PG PE 株系,将反义PE 和PG 基因构建成嵌合基因导入植物.发现2种方法得到的转基因植株,表现出每一反义基因所引起的表型变化,而且可溶性固形物含量增加,果实主要加工性能也得到明显改善.3.3　色素生物合成分子水平操作在大多数肉质果实中,成熟变化包括软化、变色、变甜及特殊风味与香气的挥发等[49].果实的颜色是决定果实外观品质的重要因素之一[50].利用基因工程改变果实色泽,提高果实外观品质的研究,目前也取得了一定进展.从成熟番茄c DNA 文库中筛选到一克隆pTOM 5,其核苷酸序列与细菌来源的八氢番茄红素焦磷酸合成酶基因具有同源性.该酶催化八氢番茄红素的合成,八氢番茄红素是类胡萝卜素合成途径中的一个中间产物.转基因番茄pTOM 5反义RNA 表达的研究,证实pTOM 5的基因产物参于果实成熟时类胡萝卜素的合成.转基因番茄果实成熟时颜色发黄,花也变成淡黄,这一特性恰好与“黄肉”番茄突变体特征相符合,而且在转基因番茄中检测不到番茄红素,进一步研究表明“黄肉”基因和pTOM 5都位于第3染色体上[51].用基因工程方法使黄肉番茄突变体过量表达pTOM 5基因,发现类胡萝卜素、番茄红素合成能力得到恢复,从而证明“黄肉”突变体中缺少八氢番茄红素合酶.从另一个角度讲,如果pTOM 5基因在番茄中过度表达,那么果实颜色将会加深,这有可能解决转基因果实在色泽上居于劣势的问题.另外在苹果中有关花青苷的形成、积累等分子生物学方面的研究也较深入[52].花青苷是由黄酮类色素物质组成的,而苯基苯乙烯酮合成酶(CH S )是黄酮类色素物质合成途径中的关键酶.在矮牵牛属(P etunia )植物已成功应用反义RNA 技术抑制CH S 基因的表达,使得花卉颜色从野生型的紫色转变为白色,并且因对CH S 基因表达的抑制程度的差异而出现了一系列中间类型的花色.同样,在烟草中,反义RNA 抑制CH S 基因的表达,花冠颜色从野生型的桃红色转变为白色[53].因此,是否可以采用类似技术改变苹果等果树果实颜色,是个令人感兴趣的问题.4　结束语植物分子生物学的飞速发展,使我们能够利用反义技术调节果实成熟,不仅有助于对与成・524・第4期 宋刚等:反义RNA 技术控制果实成熟的研究进展熟有关的生理生化基础,作进一步深入研究,而且为解决生产实际问题展示了美好前景.我国地处亚热带和温带地区,有许多闻名世界的地方特色水果.使用传统保鲜技术不可能从根本上解决问题.基因工程番茄的商品化,无疑为基因工程方法控制其它果实成熟在技术上铺平了道路.在苹果、桃、梨、杏、猕猴桃、枇杷等典型的跃变型果实中,控制C 2H 4生物合成的基因表达和调控机制应具有很大相似性,因此可以借鉴和应用番茄转基因技术调控这些果实的成熟和转化,从而提高果实的耐贮性、品质和色泽.关于果实成熟的分子生物学及转基因的研究,目前国内尚处于起步阶段,但进展相当快,相信不久的将来,将会取得丰硕成果.参考文献:[1]闻伟,杨胜利.反义RNA 在基因调控中的作用[J ].生物工程进展,1990,10(3):38-43.[2]宋艳茹,谢安勇.植物基因工程中反义RNA 的应用[J ].植物学通报,1990,7(4):13-17.[3]S I M ON S R ,KL ECKN ER N .T ran slati on con tro l of IS 10tran s po siti on [J ].Cell ,1983,34:683-691.[4]IZ AN T J G ,W E I N TRAUB H .Congtitutive and conditi onal supp ressi on of exogenous and 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