食品安全检验技术（理化部分） 食品安全检验技术（理化部分） 食品中蛋白质含量的测定
1、常量凯氏定氮法 、
将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化， ⑴原理 将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化， 使蛋白质分解，其中C和 被氧化为 被氧化为CO 逸出， 使蛋白质分解，其中 和H被氧化为 2和H2O逸出， 逸出 而样品中的有机氮转化为NH3，并与 2SO4结合成 并与H 而样品中的有机氮转化为 NH4SO4，此过程称为消化。加碱将消化液碱化，使 此过程称为消化。加碱将消化液碱化， NH3游离出来，再通过水蒸气蒸馏，使NH3蒸出，用 游离出来，再通过水蒸气蒸馏， 蒸出， 硼酸吸收形成硼酸铵， 硼酸吸收形成硼酸铵，再以标准盐酸或硫酸溶液滴 根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。 定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
c(V1 − V2 ) × 0.0140 X= × F ×100 10 m× 100
式中
蛋白质的含量， Ｘ----蛋白质的含量，g/100g； 蛋白质的含量 ； c----硫酸或盐酸标准溶液的浓度，mol/L； 硫酸或盐酸标准溶液的浓度， 硫酸或盐酸标准溶液的浓度 ； V1----滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL； 滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积， ； 滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积 V2----滴定空白吸收液溶液体积， ； 滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积 m----样品质量 ，g； 样品质量g， ； 样品质量 0.0140----1.0mL1.000mol/L硫酸（1/2H2SO4）或盐酸标准溶液相当 硫酸（ 硫酸 ） 的氮的质量， 的氮的质量， g/mmol ； F----氮换算为蛋白质的系数。 氮换算为蛋白质的系数。 氮换算为蛋白质的系数
食品安全检验技术（理化部分） 食品安全检验技术（理化部分） 食品中蛋白质含量的测定 ⑷操作方法 样品消化：样品消化步骤同常量法。 ① 样品消化：样品消化步骤同常量法。 将消化完全的消化液冷却后，完全转入100mL容量瓶中， 容量瓶中， 将消化完全的消化液冷却后，完全转入 容量瓶中 加蒸馏水至刻度，摇匀。 加蒸馏水至刻度，摇匀。 ② 蒸馏：按图装好微量定氮装置，准确量取消化稀释液 蒸馏：按图装好微量定氮装置， 10mL于反应管内，经漏斗再加入 于反应管内， 于反应管内 经漏斗再加入10mL400g/L氢氧化钠溶 氢氧化钠溶 液使呈强碱性，用少量蒸馏水洗漏斗数次，夹好漏斗， 液使呈强碱性，用少量蒸馏水洗漏斗数次，夹好漏斗，进 行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有10mL40g/L（或 行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有 （ 20g/L）硼酸吸收液的液面下。蒸馏至吸收液中所加的混 ）硼酸吸收液的液面下。 合指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏10min后，将冷凝 合指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏 后 管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后 管尖端提离液面再蒸馏 ， 停止蒸馏。馏出液用标准溶液滴定至微红色为终点。 停止蒸馏。馏出液用标准溶液滴定至微红色为终点。同时 做一空白试验。 做一空白试验。
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二、蛋白质的分光光度测定法
凯氏定氮法是各种测定蛋白质含量方法的基础，但操 凯氏定氮法是各种测定蛋白质含量方法的基础， 作费时，且在操作中会产生大量有害气体而污染工作环境， 作费时，且在操作中会产生大量有害气体而污染工作环境， 影响操作人员健康。 影响操作人员健康。而分光光度测定法不仅能满足对工艺 过程的快速控制分析，而且具有环境污染少， 过程的快速控制分析，而且具有环境污染少，操作简便省 时等特点。 时等特点。 基本原理：食品与硫酸和催化剂一同加热消化， ⑴基本原理：食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白 质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后在pH=4.8 质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后在 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中 乙酸缓冲溶液中， 的乙酸钠 乙酸缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生 成黄色的3,5-二乙酰 二乙酰-2,6-二甲基 二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。 二氢化吡啶化合物。 成黄色的 二乙酰 二甲基 二氢化吡啶化合物 在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量，结果 处测定吸光度， 在波长 处测定吸光度 与标准系列比较定量， 乘以换算系数，即为蛋白质含量。 乘以换算系数，即为蛋白质含量。
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⑵适用范围 此法可应用于各类食品中蛋白质含量的测定。 此法可应用于各类食品中蛋白质含量的测定。 ⑶试剂 ①浓硫酸 ②硫酸铜 ③硫酸钾 氢氧化钠溶液： ④氢氧化钠溶液：400g/L 硼酸溶解于500mL热水 硼酸吸收液：40g/L，称取20g硼酸溶解于 ⑤硼酸吸收液：40g/L，称取20g硼酸溶解于500mL热水 摇匀备用。 中，摇匀备用。 标准溶液： ⑥ HCl标准溶液：0.1000mol/L。 标准溶液 。 甲基红-溴甲酚绿混合指示剂 溴甲酚绿混合指示剂： 份 溴甲酚绿95% ⑦甲基红 溴甲酚绿混合指示剂：5份2g/L溴甲酚绿 溴甲酚绿 乙醇溶液与1份 甲基红乙醇溶液混合均匀。 乙醇溶液与 份2g/L甲基红乙醇溶液混合均匀。 甲基红乙醇溶液混合均匀
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蒸馏、 ② 蒸馏、吸收
按图装好蒸馏装置，在水蒸气发生瓶内加入100mL蒸 按图装好蒸馏装置，在水蒸气发生瓶内加入 蒸 馏水约2/3处 玻璃珠数粒， 馏水约 处、玻璃珠数粒，加甲基红指示液数滴及数毫 升硫酸，以保持水呈酸性， 升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生瓶内的 塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（ 水。塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内预 先装有10mL 20g⁄L硼酸溶液及混合指示剂 硼酸溶液及混合指示剂1~2滴）。准 先装有 硼酸溶液及混合指示剂 滴）。准 确吸取10mL样品处理液由小漏斗流入反应室，并以 确吸取 样品处理液由小漏斗流入反应室， 样品处理液由小漏斗流入反应室 10mL水洗涤小烧杯使之流入反应室内，塞紧玻璃塞。 水洗涤小烧杯使之流入反应室内， 水洗涤小烧杯使之流入反应室内 塞紧玻璃塞。 从安全漏斗中慢慢加入10mL400g/L氢氧化钠，溶液应呈 氢氧化钠， 从安全漏斗中慢慢加入 氢氧化钠 蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。 蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。用直火加热蒸馏 30min，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏 ，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏1min，用蒸 ， 馏水淋洗尖端后停止蒸馏。 馏水淋洗尖端后停止蒸馏。
食品安全检验技术（理化部分） 食品安全检验技术（理化部分） 食品中蛋白质含量的测定 ⑷主要仪器 如图，凯氏烧瓶（ 定氮蒸馏装置。 如图，凯氏烧瓶（500mL)定氮蒸馏装置。 定氮蒸馏装置
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① 样品消化
准确称取固体样品0.20~2.00g（半固体 （ 准确称取固体样品 样品2.00~5.00g，液体样品 样品 ， 10.00~25.00mL），小心移入干燥洁净的 ），小心移入干燥洁净的 ）， 500mL凯氏烧瓶中，加入研细的 凯氏烧瓶中， 凯氏烧瓶中 加入研细的0.2g硫酸 硫酸 硫酸钾及20ml浓硫酸，小心摇匀后， 浓硫酸， 铜、6g硫酸钾及 硫酸钾及 浓硫酸 小心摇匀后， 按图安装消化装置，瓶颈45° 按图安装消化装置，瓶颈 °角倾斜置电 炉上，在通风橱内加热消化）。 炉上，在通风橱内加热消化）。 先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后， 先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后， 加大火力保持瓶内液体微沸，消化至溶液呈蓝绿色透明后， 加大火力保持瓶内液体微沸，消化至溶液呈蓝绿色透明后， 再继续加热微沸0.5h，取下冷却，小心加入20mL水，移 再继续加热微沸 ，取下冷却，小心加入 水 容量瓶中， 入100mL容量瓶中，用少量水洗定氮瓶，并入容量瓶中， 容量瓶中 用少量水洗定氮瓶，并入容量瓶中， 再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。 再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。
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2、微量凯氏定氮法 、
⑴原理 同常量凯氏定氮法。 同常量凯氏定氮法。 ⑵主要仪器 凯氏烧瓶（ 凯氏烧瓶（100mL） ） 微量凯氏定氮装置（如图） 微量凯氏定氮装置（如图） ⑶试剂 0.01000mol/L盐 盐 酸标准溶液， 酸标准溶液，其他试剂同 常量凯氏定氮法。 常量凯氏定氮法。
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一、凯氏定氮法
新鲜食品中的含氮化合物大多以蛋白质为主体， 新鲜食品中的含氮化合物大多以蛋白质为主体，所 以检验食品中蛋白质时，往往测定总氮量， 以检验食品中蛋白质时，往往测定总氮量，然后乘以蛋 白质换算系数，即可得到蛋白质含量。 白质换算系数，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用 于所有动物性、植物性食品的蛋白质含量测定， 于所有动物性、植物性食品的蛋白质含量测定，由于样 品中含有少量核酸、生物碱、含氮类脂、 品中含有少量核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮 色素等非蛋白质含氮化合物， 色素等非蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白 质含量。 质含量。 该法分常量法、微量法、改良凯氏定氮法、 该法分常量法、微量法、改良凯氏定氮法、自动定 氮仪法、半微量法等多种方法。 氮仪法、半微量法等多种方法。
食品安全检验技术（理化部分） 食品安全检验技术（理化部分） 食品中蛋白质含量的测定 ⑵主要仪器：分光光度计；电热恒温水浴锅 主要仪器：分光光度计； 具塞玻璃比色管。 （100±0.5）℃；10mL具塞玻璃比色管。 ± ） 具塞玻璃比色管 ⑶试剂 氢氧化钠溶液： ①氢氧化钠溶液：300g/L。 。 乙酸： ② 乙酸：1mol/L。 。 对硝基苯酚指示剂溶液： ③对硝基苯酚指示剂溶液： 乙酸钠-乙酸缓冲溶液 乙酸缓冲溶液： ④乙酸钠 乙酸缓冲溶液：pH=4.8。 。 显色剂： 甲醛与7.8mL乙酰丙酮混合，加 乙酰丙酮混合， ⑤显色剂：15mL37%甲醛与 甲醛与 乙酰丙酮混合 水稀释至100mL,剧烈振摇，混匀（室温下放置稳定 剧烈振摇， 水稀释至 剧烈振摇 混匀（室温下放置稳定3 日）。