引物设计界面 First you can design the primer
manually
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
引物搜索选项设定
引物类型 搜索模式 引物长度
5’引物位置 范围
3’引物位置 范围
PCR引物设计及相关软件使用
主要内容
PCR介绍 引物设计原理 引物设计的优化原则 Primer Premier 5.0 介绍 举例说明引物的设计

PCR介绍
1、什么是PCR
2、PCR的组成
3、如何提高PCR成功率 （定量，对照）
引物设计原理
引物设计的目的是为了找到一对合适 的核苷酸片段，使其能有效地扩增模 板DNA序列。引物设计总体上包含三 个程序：序列下载，同源性比较，引 物设计筛选 。
产物大小范 围
搜索结果
28对引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信 息
双击选中一对 引物
回到主窗口
引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross dimer
一对理想的引物应当不存在任何一种上述结 构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有 But …

选中引物
上游引物
下游引物 只是示意图
引物分析

首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚 体形成的可能性。
引物分析

二项检查是发夹结构（hairpin）；与 二聚体相同，发夹结构的能值越低越 好。
引物分析
第三项检查为GC 含量，以45-55％为 宜。 第四False priming 检查

引物分析 Key information of primer

Primer Premier 5.0 的使 用技巧简介
主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析
简并引物设计
根据氨基酸序列来设计引物DNA引物 Premier Primer 5提供了8种生物遗传密 码使用的偏好选择

1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear） 2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion） 3、支原体（Mycoplasma） 4、植物线粒体（Plant Mitochondrion） 5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion） 6、一般标准（Standard） 7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion） 8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）
一般原则
3，引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位 碱基在错配位置导致不同的扩增效率 ，末位碱基为A 的错配效率明显高于 其他3 个碱基，因此应当避免在引物 的3’端使用碱基A。另外，引物二聚 体或发夹结构也可能导致PCR 反应失 败。5’端序列对PCR 影响不太大， 因此常用来引进修饰位点或标记物。
引物设计的原则
11、引物的5′端 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰 ，引物5′ 端修饰包括：加酶切位点、 标记生物素、荧光、地高辛等；引入 蛋白质结合DNA序列；引入点突变、 插入突变、缺失突变序列；引入启动 子序列等。
引物设计的原则
12、在DNA测序和PCR中最好用5′末端 稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太 稳定(如AT含量较多)的引物
Per 25-mer
GC% graph
Per 25-mer
Stability
Per 5-mer
Oligo 6.44 使用说明
主要功能：专门的引物设计软件
Oligo 6.44 启动界面
Open sequence file
3个弹出窗口
Melting temperature
∆G Internal Stability
Dimer and cross Dimer Hairpin
GC%
Total PCR information
Final PCR information
Search for primer using Oligo 6.44
Search primer
Online primer3 service

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Primer Premier 5.0 简介
主要功能:
1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析
Primer Premier 5.0使用介绍 Load sequence
Preimer Premier 启动界面
引物设计的原则
1、引物长度 大多数应用的最短引物长度为18个核 苷酸。如果期待的产物长度等于或小 于500 bp，选用短的(16～18)的引物； 若产物长5 kb，则用24个核苷酸的引 物。有人用20～23个核苷酸引物得到 40 kb的产物。
引物设计的原则
2、引物GC含量
GC含量在40%－60%之间，以45-55％ 为宜。这可为有效退火提供足够热。
一般原则


引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp ，但不应大于38。 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物 长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存 在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个 长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点 只有1/400个. 较长的引物（28-35bp) 一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用 于产生一些突变位点
Tm值的计算 一般的公式 Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 对于长一些的引物可用更为准确的 nearest-neighbor （Frier et al. (1986) ）

一般原则
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较 高，尤其是3’端相似性较高的序列 ，否则容易导致错配。引物3’端出 现3 个以上的连续碱基，如GGG 或 CCC，也会使错误引发机率增加。
5、引物序列与模板序列组成的相似性
可能的错误引发位点决定于引物序列 组成与模板序列组成的相似性，相似 性高则错误引发率高 。
引物设计的原则
6、最好在模板cDNA的保守区内设计
DNA序列的保守区是通过物种间相似 序列的比较确定的。在NCBI上搜索不 同物种的同一基因，通过序列分析软 件（比如DNAman）比对（Alignment ），各基因相同的序列就是该基因的 保守区。
引物设计的原则
7、引物自身及引物之间不应存在互补序 列 引物自身不应存在互补序列，否则引 物自身会折叠成发夹结构（Hairpin） 使引物本身复性。这种二级结构会因 空间位阻而影响引物与模板的复性结 合。
引物设计的原则
8、碱基要随机分布
引物序列在模板内应当没有相似性较 高，尤其是3’端相似性较高的序列，否 则容易导致错误引发（False priming） 。
PCR引物设计

引物设计是PCR 技术中至关重要的一 环。使用不合适的PCR 引物容易导致 实验失败：表现为扩增出目的带之外 的多条带（如形成引物二聚体带）， 不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。 可以直接提交模板序列到特定网页， 得到设计好的引物，也可以在本地计 算机上运行引物设计专业软件。
Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件 中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。
用Oligo 设计引物时的3个标准
Tm 值曲线以选取5’到3’的下降形状 有利于引物引发聚合反应。 Frq 曲线宜选用3’端Frq 值相对较低 的片段。 Δ G 值在5’端和中间值比较高，而在 3’端相对低
一般原则
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%， 过高或过低都不利于引发反应。上下 游引物的GC含量不能相差太大。 不同的算法推荐45-55%或50-60%
一般原则
5. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由 能，该值反映了双链结构内部碱基对 的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值 较低（绝对值不超过9），而5’端和 中间∆G 值相对较高的引物。引物的 3’端的∆G 值过高，容易在错配位点 形成双链结构并引发DNA 聚合反应。 （能值越高越容易结合）
一般原则Байду номын сангаас
6. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶 切位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。
一般原则
7. 引物二级结构对PCR反应的影响。 尽可能少的引物二聚体。
常用的引物设计软件
Oligo 6 （引物评价）* Primer Premier （自动搜索）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）*
Primer Premier 5.0使用介绍 (1) Load sequence
Preimer Premier 启动界面
基本信息
Sequence name Original sequence
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好
引物设计的原则
9、引物应具有特异性
引物设计完成以后，应对其进行检测 。如果与其它基因不具有互补性，就 可以进行下一步的实验了。
引物设计的原则
10、ΔG值 ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合 的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG 值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间 ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且 不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对 值），如此则有利于正确引发反应而 可防止错误引发。