点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固 定液易流失，从而导致柱效降低，被键 合相填料所取代。 3．正相色谱-固定液极性 > 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱， 适于分离极性组分。 反相色谱-固定液极性 < 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适 于分离非极性组分。
1）硅胶： <>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低 <>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。 <>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
2．进样系统 a 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） >GC系统压力较小，可以 >HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期） b 阀进样：不必停泵，六通阀
3．分离系统-色谱柱 >直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料 >柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） >色谱柱维护 >预柱和预饱和柱
（二）反相键合相固定相
1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓

二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）
三、化学键合相色谱（CPC）
键合相色谱基本上属于分配色谱，与液液分 配色谱固定相不同的是“固定液”以化学键的形 式与基体结合在一起的。
（一）常规化学键合相
利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面
1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础） 2．特点：
不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱
5）其他检测器
化学发光检测器、质谱检测器等
5．附属系统 梯度淋洗(洗脱)装置
洗脱方式有： 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）
>以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一元泵） >类似GC的等温度洗脱 2）梯度洗脱： 梯度淋洗指在分离过程中使流动相的组成随时 间改变而改变。 >即不断改变溶剂极性（二元泵） >适于分析极性差别较大的复杂组分 >类似GC的程序升温（沸程较长样品）
原理-吸附 特点-峰易拖尾 适用-分离极性化合物
2）高分子多孔小球： 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物
3．流动相
除了最基本的要求之外，主要考虑溶剂强度， 溶解度参数及极性参数等。
二、液液分配色谱法（LLC）
1．分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异 2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺
一、液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂
1．分离原理：利用组分分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
2．固定相
<>分为极性和非极性两类 <>极性固定相：
硅胶、氧化铝和氧化镁、硅酸镁分子筛等，其 中极性硅胶应用最普遍。 <>非极性固定相： 多孔微粒活性碳、多孔石墨化炭黑，以及高分 子多孔微球等。
2．流动相的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用
力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用
力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
4）电化学检测器：
常用的有电导检测器和安培检测器
电导检测器是测量物质在流动相中电离后所 引起的电导率的变化，组分浓度越高，电 离产生的离子浓度越高，电导率变化就越 大，多用于离子色谱。
安培检测器适用于测定所有在工作电极的电 压范围内发生氧化或还原反应的物质，在 生化样品分析中应用广泛，是迄今最灵敏 的HPLC检测器。
§3-3 高效液相色谱固定相和流动相
高效液相色谱法有许多类型，对于不同类型的 色谱方法所采用的固定相和流动相都有所差异，详 细可参考§3-4各类高效液相色谱法简介
§3-4 各类高效液相色谱法简介
一、液固吸附色谱法（LSC） 二、液液分配色谱法（LLC） 三、化学键合相色谱法（CBC） 四、离子色谱法（IC） 五、空间排阻色谱法（SEC）
§3-2 高效液相色谱仪
1．贮液罐（滤棒，可滤 去颗粒状物质）
2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
1．高压输液系统（泵） 恒压泵：在一定操作条件下，输出压力保持恒 定，流量随系统压力变化而变化。 恒流泵：在一定操作条件下，输出流量保持恒 定，而与系统的压力无关。
高效液相色谱法 HPLC
（High Performance Liquid Chromatography）
§3-1 高效液相色谱法的特点
一、高效液相色谱法 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。
它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）
4．检测系统 1）紫外-可见吸收检测器UV-Vis： 适用于吸收紫外或可见光的物质 灵敏度较高，应用范围较广 (光电二极管阵列检测器DAD) 2）荧光检测器FLD： 只能分析具有荧光活性的物质 灵敏度高，但适用范围有限 3）示差折光检测器RID： 利用折光率的差别来检测，为通用型 检测器，但灵敏度低，温度要求严格