传染病-实习报告实习报告学院: 动物医学院课程: 兽医传染病学实习班级: 动医10*班学号: 171102**姓名: **指导教师: 王先炜职称: 副教授实习时间2013年5月26日至2013年5月31日实习地点逸夫楼40172013年6月南京农业大学教务处制实习报告一、实习目的1.以副猪嗜血杆菌病和蓝耳病为模型，学习传染病的临床诊断技术；2.通过对感染猪体内病毒和细菌的分离鉴定，学习掌握细菌性猪病、病毒性猪病的实验室诊断方法。

3.掌握畜禽传染病的临床诊断技术。

4.掌握畜禽传染病实验室诊断方案的设计、诊断试剂的准备和检测结果分析判定。

5.掌握畜禽细菌与病毒混合感染的病原分离与鉴定技术。

6.掌握细菌药敏试验指导畜禽临床用药。

二、实习安排时间地点内容星期一5月26日白天逸夫楼4017诊断试剂的配制；器皿的准备以及灭菌的处理星期二5月27日白天逸夫楼4017病料的采取与处理；细菌的涂片检查与分离培养星期三5月28日白天逸夫楼4017病毒的分离接种（病料过滤和接种细胞）；分离细菌镜检和增殖星期四5月29日晚上逸夫楼4017细菌的生化试验、药敏试验和细菌鉴定；观察接种细胞星期五5月30日江浦农场参观学习星期六5月31 日下午逸夫楼4017病毒细胞病变观察、菌落鉴定三、实习内容日期：2014.5.26 星期：星期一白天王先炜老师讲解本周传染病学实习的主要内容和实习目的，包括传染病临床诊断的主要方法及及操作，实习过程中的注意事项，将48名同学分为12小组，本组为第12组。

分组进行实验器材的领取和准备。

准备实验器采集病畜病１实验准备（一）灭菌消毒用品：手术刀片、手术刀柄、剪刀、大镊子、小镊子、剪刀、黄色枪头一盒、用锡箔纸包好小滤器、玻璃匀浆器、1.5mL离心管、PCR管。

（二）其他用品：解剖盘、酒精灯、酒精棉球、解剖刀、记号笔、注射器、染色缸、乳胶手套、接种环、载玻片、细菌涂布棒、倒置显微镜等。

（三）试剂及配制1.TSA平板（6块以上）成分：TSA：8g 琼脂粉：0.08g去离子水 200mL121℃， 15-20min，冷却至50℃左右，加入5mL的小牛血清，2.5mLNAD2.TSB液体培养基（10管）成分：TSB：1.8g去离子水：50ml混匀后可分装小试管内（每管3mL） 121℃，15-20min用之前每只试管加1μL血清，1μLNAD血清：用前要灭能（56℃， 40min）3.生理盐水：0.45g NaCI 加入50mL去离子水，然后高压灭菌4.细胞维持液：在50ml的DMEM液中加入1ml的血清和1ml的双抗（青、链霉素）(研究生配制）；5.TE缓冲液（一起配置）：①10*TE buffer (100ml)1M Tris-HCl buffer （PH=8） 10ml500mM EDTA(PH=8) 2ml定容至100ml，高压保存②1M Tris-HCl （PH=8）（100ml）12.11g Tris至80ml去离子水，加4.2ml浓HCl，定容至100ml，高压灭菌③500mM EDTA（PH=8）18.61g Na2EDTA•H2O至80ml去离子水，加2gNaOH，定容至100ml（四）倒TSA平板将TSA溶液高压后冷却至60℃左右，加入小牛血清和NAD。

然后将平板边沿用酒精灯外焰灼烧消毒，将TSA溶液倒入平板中，均匀铺满整个平板，待其冷却凝固后，标记好班级，组名和时间等备用。

日期：2014.5.27 星期：星期二细菌学检查和病毒学检查病料取样。

1．细菌的分离培养：取病猪肺脏（冰冻组织需充分解冻），用酒精棉球点燃消毒肺脏表面，无菌手术刀切口，将接种环伸入于肺脏肺泡内，无菌划线接种TSA平板。

具体操作如下：２a)右手执笔式持接种环，在酒精灯火焰上灼烧接种环，待冷；b)左手抓紧琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬起一些，进行接种。

或者，将平皿盖放在试验台上，尽量直立平皿靠近酒精灯火焰；c)右手接种环在琼脂的一端涂布，划线时，接种环与琼脂表面是30°-40°的角度轻轻接触，利用腕力动作，切忌划破琼脂表面；d)接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号笔注明接种时间，接种者等，然后将平皿的底朝上，放置在37°温箱内培养24-48小时（培养后可出现多种菌落，注意区分不同培养时间点不同类型菌类形态）。

2．组织触片和染色观察：a)触片：取一小块肺脏组织，在洁净的载玻片上轻轻地作2～3 个压迹，制成触片；b)干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形；c)固定：在酒精灯处快速的来回通过2-3秒钟，并不时以载玻片背面接触皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色；d)初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min；e)水洗：用洗瓶中自来水冲洗，直至洗下的水呈无色为止；f)媒染：用100-1000μL移液枪吸取约300μL碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min；g)水洗：用洗瓶中自来水冲洗，直至洗下的水呈无色为止；h)脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗；i)复染：滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖触片约1min；j)水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止；k)干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。

3．病毒学病料处理a) 临床上各种疾病的症状非常相似，而且极易发生混合感染，因此确诊需依赖于实验室的诊断。

病毒性疾病的实验室检验的大致程序如下：临床标本→分离培养→初步鉴定→最后鉴定。

b) 用剪刀剪取病变明显的肺脏部位，置于小青瓶或平皿中，用小剪刀剪成大小约1mm3的碎块，然后加入等量灭菌生理盐水或PBS，置于玻璃匀浆器中进行匀浆，组织匀浆液倒入小青瓶中，置于-20℃冰箱冻存备用。

c) 老师帮助我们反复冻融三次。

日期：2014.5.28 星期：星期三白天（一）细菌的镜检和增殖培养温箱培养24h，挑取疑似菌落（HPS为无色或淡灰色，半透明小菌落），制备细菌涂片，革兰氏染色，镜检，将疑似菌落进行再次划板纯化。

（镜检：革兰氏染色阴性，两极着色，杆菌）挑取单个纯培养的菌落，用接种环接种到TBS液体培养基中，37℃，振摇培养16-32h。

３（二）病毒细胞接种1显微镜观察母细胞的生长状态：在显微镜下观察母细胞的生长密度和生长状况。

2.细胞接种：在细胞板中加入过滤后的组织上清液，使其铺满细胞表面，置于37℃二氧化碳培养箱孵育1h；弃去组织滤液，在细胞中加入细胞维持液，37℃二氧化碳培养箱培养，每天观察细胞生长情况和有无病变。

（三）RNA的提取1.取100ul分离病毒液，加入1mlTrizol试剂，匀浆，室温静置2-3min；2.加入200ul氯仿，剧烈震荡，室温静置2-3min；4℃12000rpm离心15min；3.取上清，加入等体积的异丙醇，室温静置10min；4℃12000rpm离心10min；4.弃上清，加入1.0ml75%乙醇，振摇，4℃12000rpm离心5min；5.弃上清，干燥沉淀物（室温约5min）；加入20ulDEPC水溶解沉淀。

（四）RT-PCR（鉴别高致病性和非高致病性毒株）上游引物：5'-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3'下游引物：5'-ATRATGGCTTGAGCTGAG-3'PCR反应体系（总体系为25ul)模板4ul（上述RNA提取备用液）10*Mg2+free butter 2.5ul2.5mmol•L-1Mg2+ 2.0ul25mmol•L-1Mg2+ 1.0u l20p mol•L-1Dnsp1161 0.5u l20p mol•L-1Dnsp1928 0.5u lTaq DNA聚合物0.3ul灭菌双蒸水14.2ul反应循环参数为：94℃3min，48℃45s，72℃75s，进行5个循环；然后94℃1min，54℃45s，72℃75s，进行34个循环；72℃延伸10min。

取8.0ul的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。

日期：2014.5.28 星期：星期四晚上6:00——9:30（一）细菌学实验1.实验材料：①生化反应管：商品化的葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖、麦芽糖、尿素、乙酰胺、硫化氢、鸟氨酸脱羧酶生化反应管。

②商品化试剂：药敏试纸、PCR试剂、引物、琼脂糖③细菌：商品化金黄色葡萄球菌2.细菌的生化试验用接种针（无菌）取分离的细菌24h纯培养物分别接种到含葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖、麦芽糖、尿素、乙酰胺、硫化氢、鸟氨酸脱羧酶的生化反应管中，开口向下，放到灭菌培养基中，37℃培养24h，观察结果并记录。

同时进行脲酶试验、氧化酶试验和接触酶试验。

（1）糖类分解试验原理：接种细菌若发酵某种糖或醇，可产酸，使培养液颜色由紫色４变为黄色；如发酵的同时又产生气体，培养液颜色由紫色变为黄色的同时，在微量发酵管顶部积有气泡。

结果判定：接种后24h观察结果。

产酸，培养液颜色由紫色变为黄色；产酸产气，培养液颜色由紫色变为黄色，并在微量发酵管顶部积有气泡。

（2）脲酶试验原理：细菌分解尿素产生两分子氨，培养基pH升高，指示剂酚红显示出红色，即证明细菌有脲酶。

接种方法及结果判定：用接种环将细菌培养物接种与尿素琼脂斜面，不要穿刺到底，下部留作对照。

1～6h观察，有时需要24h到6d。

阳性反应，则琼脂斜面有粉红到紫红色。

阴性反应，不变色。

（3）氧化酶试验原理：氧化酶或称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。

作氧化酶试验时，此酶首先使细胞色素C氧化，然后氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。

接种方法及结果判定：取白色洁净滤纸沾取菌落。

加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深，再加α-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。

阴性于两分钟内不变色。

（4）接触酶试验（也叫做触媒实验或者过氧化氢酶实验）原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。

接种方法及结果判定：取槽置于洁净的试管内或玻片上，然后加3％过氧化氢数滴；或直接滴加3％过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。

有大量气泡产生者为阳性。

不产生气泡者为阴性。

（5）硫化氢试验原理：细菌分解含硫氨基酸，产生硫化氢，与培养基中的醋酸铅或硫酸亚铁发生反应，形成黑色的硫化氢或硫化亚铁。