・继续教育园地・血细胞分析仪检测原理乐家新 周建山 兰亚婷 传统的血细胞检查完全采用手工方法,不仅操作繁琐费时,而且由于多种原因,计数结果的准确性和精密度难以保证。
1958年,库尔特采用电阻率变化与电子技术相结合的方法,发明了性能比较稳定的电阻抗法血细胞计数仪,开创了血细胞分析的新纪元。
20世纪90年代以来,随着各种高新技术在血细胞分析仪中的应用,使其检测原理不断完善,检测水平不断提高,测量参数不断增加,各种类型的血细胞分析仪已在国内外各医院广泛使用。
但从根本上讲,其检测原理大致分为两部分,即电阻抗法与光散射法。
图1 细胞计数电阻抗原理作者单位:100853北京,解放军总医院临床检验科一、电阻抗法血细胞分析技术(一)电阻抗法白细胞计数和分类原理电阻抗法白细胞计数原理是根据血细胞非传导性的性质,以对电解质溶液中悬浮颗粒在通过计数小孔时引起的电阻变化进行检测为基础,进行白细胞计数和体积测定。
在等渗电解质溶液(稀释液)中,有一个用于细胞计数的小孔管,其内侧充满了稀释液,并有一个内电极,其外侧细胞悬液(稀释液)中有一个外电极,小孔两侧的电极之间有稳定的电流。
细胞为相对不良导体,其导电性质比稀释液低,当有一个细胞通过小孔时,于瞬间引起了电压变化而出现一个脉冲信号。
脉冲的数量与细胞的数量成正比,脉冲的高度与细胞的体积成正比。
脉冲信号经放大、阈值调节、甄别、整形后,送入计数系统进行处理,得出被测细胞的数量。
图1显示出血细胞计数仪应用电阻抗原理进行细胞计数及体积分析的方法及过程。
目前,许多仪器除给出细胞数外,还同时提供可以表示细胞群体分布情况的图形———直方图。
可显示出某一特定细胞群的平均细胞体积、细胞分布情况和是否存在明显的异常细胞群,由脉冲累积得到。
如图2所示,左图为示波器显示的所分析细胞的脉冲大小,右图为相应的体积分布直方图,横坐标为体积,纵坐标为相对数量。
在进行白细胞分析时,仪器将体积范围从35～450fl 分为256个通道,每个通道约为1164fl ,并将每个白细胞的脉冲根据其体积大小分类并储存在相应的体积通道中。
再由计算机拟合成一条平滑曲线,从而得到白细胞体积分布直方图(见图3),其纵坐标表示白细胞的相对数量(REL No 1),横坐标表示白细胞体积(单位:fl )。
电阻抗法得到的白细胞分类值是根据各群细胞在白细胞直方图上所占面积的大小计算得来的(见图4)。
白细胞计数池中除加入一定量的稀释液外还加入了溶血剂,此溶血剂一方面使红细胞溶解;另一方面使白细胞浆经胞膜渗出,胞膜紧裹在细胞核或存在的颗粒周围,使白细胞成为“膜包核”。
仪器将体积在35～450fl 的这种颗粒认定为白细胞,并根据其体积大小在直方图上从左至右初步确认其相应的三个细胞群。
在正常白细胞直方图上,小细胞群是位于左侧又高又陡的峰,分布在35～90fl 范围,以成熟淋巴细胞(L YM )为主要特征细胞;大细胞群是位于右侧较低且分布宽的峰,跨越160～450fl ,以中性粒细胞为主要特征细胞;位于大、小细胞群之间的较平坦的区域,分布在90～160fl 范围,是单个核细胞(MONO ),也被称为中间细胞(MID ),以单核细胞为主要特征细胞。
仪器根据各细胞群占总体的比例计算出相应的百分比,如果与该标本的白细胞总数相乘,即得到各类细胞的绝对值。
图2 脉冲信号与直方图的关系图3 白细胞体积分布直方图图4 白细胞分类计数计算方法示意图图5 电阻抗法血小板测试原理 (二)电阻抗法红细胞检测原理根据各参数的检测原理不同,大致分为3个部分。
11红细胞(RBC )计数和红细胞比容测定原理:其原理同白细胞检测相同。
即当RBC 通过小孔时,形成相应大小的脉冲,脉冲的多少代表RBC 的数量,脉冲的高度代表单个细胞的体积。
脉冲高度叠加,经换算即可得HCT 。
有的仪器先以单个细胞高度计算出红细胞平均体积(MCV ),再乘以红细胞数,得出HCT 。
仪器根据所测单个细胞体积及相同体积细胞占总体的比例,可打印出红细胞体积分布直方图。
尽管计数红细胞的血样中含有白细胞,但由于正常血液中红细胞∶白细胞约为750∶1,故白细胞因素可忽略不计。
在某些病理情况下(如白血病),白细胞数明显增加而又伴严重贫血时,可使所得红细胞各项参数产生明显误差,需要校正后方可发出检验报告。
21血红蛋白测定原理:在稀释的血液中加入溶血剂后,红细胞被溶解,释放出血红蛋白(Hb ),后者与溶血剂中有关成分结合形成Hb 衍生物,进入Hb 测试系统,在特定波长(一般在530～550nm )下比色,吸光度的变化与液体中Hb含量成正比,仪器便可显示其浓度。
不同系列血细胞分析仪配套溶血剂配方不同,形成的Hb 衍生物亦不同,其吸收光谱各异但最大吸收均接近540nm 。
校正仪器必须以HiCN 值为标准。
大多数系列血细胞分析仪溶血剂内均含有氰化钾,与Hb 作用后形成氰化Hb (注意不是HiCN ),其特点是显色稳定,最大吸收接近540nm ,但吸收光谱与HiCN 有明显不同。
此点在仪器校正时应十分注意。
31各项红细胞指数的检测原理:根据仪器检测的RBC 、HCT 和Hb 的数据,经仪器内存程序换算出红细胞平均体积(MCV )、红细胞平均血红蛋白的含量(MCH )和红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC )。
红细胞体积分布宽度(RDW )由血细胞分析仪在检测红细胞数量的过程中,同时测量红细胞体积大小的差异获得,是反映外周血红细胞体积异质性的参数。
RDW 能直接、客观、及时地反映红细胞大小不等的程度,对贫血的诊断有重要意义。
(三)血小板检测原理血小板随红细胞一起在一个系统中进行检测,根据不同的域值,计算机分别给出血小板与红细胞数目(见图5)。
血小板分别贮存于64个通道内,其体积分布直方图范围通常为2～30fl 之间。
平均血小板体积(MPV )是血小板直方图曲线所含的群体算术平均体积,正常人的MPV 值与血小板数量呈非线性负相关。
二、光散射法血细胞分析技术(一)光散射法白细胞计数与分类原理利用多项技术(如射频、细胞化学染色和流式细胞术)联合同时检测一个白细胞,综合分析实验数据,得出较为准确的白细胞五分类结果,主要有4种类型。
第一类,光散射与细胞化学技术联合的白细胞分类法:根据各类白细胞的过氧化物酶活性不同,将血液经过氧化物酶染色后,用光散射法测量白细胞的酶反应强度和体积大小,测量数据经计算机处理后得出白细胞总数和分类值。
第二类,容量、电导、光散射(VCS )白细胞分类法:血液经特殊溶血剂处理后,白细胞仍保持与体内形态相同的自然状态,使用鞘流技术使白细胞单个通过检测器,接受容量、电导、光散射三种技术的同时检测。
检测的数据经计算机处理后得出各种白细胞分类结果。
第三类,阻抗与射频技术联合的白细胞分类法:在特定的作用温度和时间内,用各自专一的溶血剂将非己细胞溶解后,利用电阻抗法在不同的系统内分别计数嗜酸性粒细胞和嗜碱粒细胞。
根据淋巴细胞、单核细胞及粒细胞的结构特点,采用电阻抗与射频联合检测方式,计数这三类细胞的比例。
再利用幼稚细胞膜上脂质较成熟白细胞少,结合的硫化氨基酸多,形态不受溶血剂破坏的特性,通过电阻抗法检测出幼稚细胞的数量。
第四类,多角度偏振光散射白细胞分类法:利用嗜碱粒细胞颗粒具有吸湿的特性和红细胞经低渗鞘流液处理后不干扰白细胞计数的特点。
利用鞘流技术,使细胞单个通过测量区,仪器从四个角度分别测定散射光的密度,所得的数据计算机处理后得到白细胞分类结果。
(二)光散射法红细胞检测原理在测试系统中,全血与红细胞/血小板稀释液混合,使自然状态下双凹盘状扁平圆形的红细胞成为球形并经戊二醛固定(RBC体积不变)。
使得红细胞无论以何种方位通过测量区时,被激光束照射后所得的信号是相同的。
激光束以低角度前向光散射和高角度光散射同时测量一个红细胞,根据低角度光散射转换能量大小,测量单个红细胞体积与总数;根据高角度光散射得出单个红细胞内血红蛋白浓度,测量数据经计算机处理后得出RBC、MCV和HCT等参数值。
(三)光散射法血小板检测原理血小板与红细胞在一个系统中测量,其原理是:根据同质性球体光散射的Mie理论,当球形化的血小板单个通过激光照射区时,仪器在两个角度测定激光的散射强度:高角度主要测细胞的折射指数(RI),它与细胞的密度有关;低角度主要测细胞体积的大小。
血小板的体积在1～30fl,RI在1135～1140之间。
由于红细胞含有高浓度的血红蛋白,其折射系数较高(RI在1135～1144),因此,大血小板虽然可能与小红细胞、红细胞碎片、红细胞残骸以及其他细胞碎片的体积相似,但因其内容物不同,RI相差较大,在血小板二维散射图上可区别并分别计数。
三、血细胞分析仪检测的质量保证血细胞分析仪虽然提高了检验结果的准确性和精密度,但欲获得准确的检测结果,必须做好分析前、分析中和分析后的质量控制。
11分析前质量控制:包括(1)做好操作人员上岗前的培训,选择高素质的专业技术人员,这是获得准确结果的关键。
(2)按仪器说明书的要求,做好仪器的安装和校正。
(3)按照ICSH公布的评价方案,对仪器测试标本的总变异性、精密度、携带污染率、线性范围、可比性和准确性进行测试、评价。
(4)注意标本的采集和贮存要求:选用ICSH推荐用EDTA 二钾(115～2mg/ml血)作为静脉血的抗凝剂,抗凝血在室温下,WBC、RBC、PL T可稳定24h,白细胞分类可稳定6～8 h,Hb可稳定数日,但2h后粒细胞形态即有变化,故需作镜检下分类者,应及早推血片。
21分析中质量控制:包括(1)了解试剂与仪器白细胞分类的关系,选用原装试剂和经国家鉴定的合格试剂;(2)注意测试时试剂的温度和溶血剂的用量及溶血时间对结果的影响;(3)了解仪器不完全堵孔对检测结果的影响;(4)做好室内质控,注意冷球蛋白和高脂血症等病理因素对仪器检测结果的影响。
31分析后质量控制:包括(1)根据白细胞直方图及参数变化确定白细胞分类是否需要显微镜检查;(2)注意分析实验结果各参数之间的关系;(3)注意与临床资料进行相关分析;(4)经常听取临床医生的意见,及时纠正潜在引起实验偏差的趋势,不断改进实验室的工作,提高检验质量。
思考题11下列哪项是血细胞分析仪法抗凝血的首选抗凝剂?A1肝素;B1草酸钾;C1EDTA22K;D1枸橼酸钠;E1 EDTA22Na21属于血细胞分析仪红细胞参数的是(多选)A1RDW;B1MPV;C1HCT;D1HG B;E1PDW31电阻抗法血细胞分析仪,与脉冲的高低成正比的是A1细胞移动的速度;B1细胞体积的大小;C1细胞的数 量;D1细胞的比积;E1细胞是否有核41根据ICSH对血细胞分析仪的评价方案,鉴定仪器需测试 (多选)A1总变异性;B1线性范围;C1携带污染率;D1敏感性; E1可比性51电阻抗法血细胞分析仪是由下列哪位发明的?A1莫尔德蓝;B1拉格克蓝茨;C1库尔特;D1法拉第; E1 麦克斯韦61关于电阻抗法血细胞分析仪红细胞比容测定下列哪项是 错误的A1直接叠加脉冲的高度获得;B1不受稀释液渗透压变 化的影响;C1严重贫血的慢性粒细胞白血病标本, 其HCT结果需要校正;D1由红细胞平均体积乘以 红细胞数获得;E1白细胞数明显增加而又伴严重 贫血时,检测结果需要校正71关于血细胞分析仪测定血红蛋白的叙述,下列错误的是 (多选)A1血红蛋白衍生物的最大吸收峰均接近540nm;B1溶 血剂含氰化钾时其反应终产物为HiCN;C1测定结 果的校正必须以HiCN为标准;D1能直接根据吸光 度进行计算;E1羟基血红蛋白法不适用于电阻抗法 血细胞分析仪81输液时同侧肘静脉采集的血标本不会影响电阻抗法血细 胞分析仪哪些检测结果(多选)A1白细胞分类值;B1血红蛋白测定;C1RDW;D1红细 胞比容测定;E1血小板计数91电阻抗法血细胞分析仪不完全堵孔时,下列哪项不受影 响A1白细胞直方图;B1红细胞计数;C1红细胞比容测 定;D1血红蛋白测定;E1MPV101关于光散射与细胞化学技术联合进行白细胞分类的叙 述中,下列哪些是错误的(多选)A1嗜碱粒细胞有很强的过氧化物酶活性;B1中性粒细胞有较强的过氧化物酶活性;C1单核细胞有弱过氧化物酶活性;D1淋巴细胞和嗜酸粒细胞无此酶;E1光散射数据代表酶反应强度正确答案可点击查询(收稿日期:2003211221)(本文编辑:唐栋)基金项目:1998年度广东省重点攻关项目资助作者单位:510630广州,中山大学附属第三医院皮肤性病科・经验交流・聚合酶链反应-单链构象的多态性技术在解脲脲原体生物群和基因型鉴定中的应用陆春 朱国兴 刘毅 本研究通过对解脲脲原体(UU)的14个标准血清型的聚合酶链反应2单链构象的多态性(PCR2SSCP)电泳分析,直接鉴定UU生物群和基因型。