①细 菌
预培养 20-24h培养 同步化 3-6℃培养1h 35-37℃培养至对数 期
基本 培养基
前培养及 诱变菌悬 液制备
培养20-60min
2℃
保藏 10min
加入一定浓度的嘌呤、嘧啶或酵母膏
加入预冷 的缓冲液 或生理盐水
离心洗涤
用无菌脱脂 棉或滤膜
悬液
加入 玻璃珠
调整浓度 备用
过滤
振荡10min
抗生素法
菌丝过滤法
制霉菌素法 夹层培养法 限量补充培养法 逐个检出法 影印接种法
同一培养皿
不同培养皿
鉴定缺陷型
生长谱法
2.营养缺陷型的诱变
• 用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍，紫 外线、亚硝酸等。其中亚硝基胍诱发频率极高， 一般可达10％。
3.中间培养（CM，培养过夜） 目的：克服表型延迟
表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于 基因型改变的现象.
分离性延迟： 突变的基因经DNA复制和细胞分裂 后变成纯合状态，表型才能表现出来。
生理性延迟： 由杂合状态变为纯合状态，突变表 型仍不能表现出来。
4.淘汰野生型菌株
⑴抗生素法
适用于：细菌和真菌
原理： 青霉素、制 霉菌素等抗生素作用 于生长着的微生物细 胞，对休止态细胞无 作用。 方法：将菌培养在含 抗生素的MM基中
不能合成
甲硫氨酸 苏氨酸
可以大 量积累
赖氨酸
作业题
什么叫做营养缺陷型菌株?在实验室中 如何从原养型菌株获得营养缺陷型菌株?请 设计一个具体实验方案。
谢 谢！
筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.
筛选方案
2.筛选的程序
⑴常规筛选程序
将随机挑选的菌落直接接入摇瓶培养，产物用常规法测定
⑵定向筛选程序
改进之处：①预筛采用琼脂块法。②初筛摇瓶发酵液中产物 的分析采用简便、快速的琼脂平板测定法。 预筛
3.菌落预筛的方法
⑴根据形态筛选变株
部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌 落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性。
使用UV照射最为方便。取5ml单细胞悬液置于直径6cm的培养皿中， 开盖照射； 时间不短于10 ~ 20s，也不长于10 ~20min。
挑选优良菌株
培养
接种分离 紫外线
Hale Waihona Puke 接种15W、30cm
5mL
出发菌株
菌体的稀释液
三、突变株的分离与筛选
1.诱变育种筛选的基本环节
设计和采用效率高的筛选方案和方法极其重要。
如目标产物与色素之间具有一定相关性。
⑵根据平板菌落生化反应筛选变株
定性和半定量检测
⑶采用冷敏感菌筛选抗生素变株
冷敏感菌是从人的病原菌中经诱变分离出的低温 敏感变异株，在20℃下不能生长，可作为检验菌 使用。
操 冷敏菌+ 诱变后的放线 菌孢子悬浮液 作：
混 合 形成抑菌圈
冷敏菌 迅速生长
20℃ 培养3-4d 37℃ 培养18-20h
b方法
稀释后的菌悬液取0.1m1 加入到基本培养中
2
1
4
3
圆滤纸分别浸湿沾取 以上四类代表物质
缺陷型所需生长因子的测定
以氨基酸缺陷为例进行说 明,将18种氨基酸按右表 分为6组 特点：每2组只有一种共同 物质
1 2 3 4 6
组 别 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 7 8 9 10 11 化合物代号 8 12 12 13 14 15 9 13 16 16 17 18 10 14 17 19 19 20 11 15 18 20 21 21
①诱变剂量的确定———突变剂量曲线
②诱变剂对产量性状的诱变作用，大致 有如下趋向：
4.诱变处理
⑴诱变处理方式
复合因子适合于遗传性稳定的纯种及 生活能力强的菌株处理，能导致较大 的突变。
先 弱 后 强
⑵诱变处理方法
适用于诱变力强而杀菌率低的诱 变剂，或只对DNA复制起作用的诱 变剂。
具体做法
设计有效的筛选方法，将少量正变 筛选（定向） 株中的优良菌株挑选出来。
诱变育种中的几个原则：
(1)选择简便有效的诱变剂
(2)挑选优良的出发菌株
(3)处理单细胞或单孢子悬液
(4)选用最适的诱变剂量
(5)充分利用复合诱变的协同效应
(6)利用和创造形态、生理与产量间的相关指标
(7)设计高效的筛选方案 (8)创造新型筛选方法
1.
一、诱变育种的设计和准备
前期准备工作
诱
变 育 种 的 设 计
出发菌株的选择与纯化
单细胞悬液的制备 诱变剂及诱变剂量的选择
诱变处理 突变体的分离与筛选 优良菌株
2.前期准备工作
⑴对出发菌株的选择
1.出发菌株的选择 与纯化
⑵出发菌株的纯化
2.菌悬液 (单孢子或单细胞悬液)的制备
⑵菌悬液制备方法
完全培养基 （CM）[+]
补充培养基 （SM）[x]
满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半 合成培养基。 在MM中有针对性地加入一或几种营养成 分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成 培养基。
1.营养缺陷型突变株的筛选步骤
原菌株(出发菌株) 诱变剂处理 中间培养
青霉素法
Auxo 的浓缩 淘汰野生型 检出缺陷型
采用青霉素法淘汰野生型细菌的方法和步骤：
⑵菌丝过滤法
适用于：丝状（放线菌、 霉菌）
原理：基本培养基上只 有野生型发育成菌丝； 突变孢子可通过滤膜， 野生型菌丝不能通过。
⑶高温杀菌法
适用于：芽孢菌 原理：利用芽孢菌类的芽孢和营养体对热的敏 感性差异，野生型芽孢荫发，营养缺陷型芽孢 不萌发。则加热后，野生型细胞大部分被杀死， 缺陷型保留下来。
适合的染料
合理设计 培养基
⑹琼脂块法大通量筛选突变株
该法是日本学者八木建立的，而由Ichilawa等在春雷 霉素产生菌选育中得到应用，取得令人满意的效果。
四、营养缺陷型菌株的诱变和筛选
营养缺陷型的筛选三类培养基
基本培养基 （MM）[-]
凡是能满足野生型菌株营养要求的最低 成分的合成培养基。
如：
头孢菌素C产生菌的有效诱变剂是：uv 、LiCl2 烷化 剂； 青霉素产生菌以烷化剂更合适。
a.遗传稳定的出发菌株：
以前未使用过 突变谱较宽 诱变率高
b. 遗传性不稳定的出发菌株：
效价高、 性能好的 一类菌落
温和诱变剂处理
环境条件
自然分离
原始菌株
出发菌株
突变体筛选
选用的诱变剂是温和的或曾经是有效的诱变剂
5
7.缺陷型菌的应用
作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变
育种、
研究代谢过程时用作亲本标记；
作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；
作为aa、维生素、碱基的测定菌株。
氨基酸合成代谢的人工控制
赖氨酸高产菌
天冬氨酸
人工诱变的 菌种不能产生
天冬氨酸激酶
高丝氨酸 脱氢酶
中间产物Ⅰ
高丝氨酸
中间产物Ⅱ
项目二 微生物的遗传变异和育种
( Microbial genetics and
breeding )
任务三 诱变育种
什么是诱变育种？
用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传 物质（ DNA ）的分子结构发生改变，引起性状
变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种
育种方法。
诱变育种的2个主要环节：
选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大 诱变（随机） 量均匀、分散的微生物细胞，以引起 绝大多数细胞致死的同时，使存活个 体中的突变频率大大提高。
最佳诱变剂的选择
预实验：生产能力分类法
⑵诱变剂的种类（高效，简便） 照射源、 照射距离、
照射时间、 处理 条件
物理诱变剂： 频度低、大损伤，难修复，且操作简便；
化学诱变剂：
频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。 ( NTG——超诱变剂） UV是最常用的一种诱变剂
浓度、处 理时间、 处理条件
⑶最适诱变剂量的选择
培养后菌丝生长延伸到盖片 以外的培养基上，揭去盖片 盖片周围部分尖端菌丝断裂
b.单菌落周围菌丝尖端法
紫外线照射或加入 杀菌率低的化学诱变剂
选择数个单菌落 筛 选
对菌落四周延伸 的菌丝尖端处理
培养
c.混合处理法
常用化学诱变剂
玻璃匀浆
培养后相当年幼的菌丝体 小段菌丝的菌 悬液进行处理
过滤
3.诱变剂及处理剂量的选择
5. 营养缺陷型的检出
①点植对照法
②影印法
该法效率高，适用于细菌、酵母菌及小型菌落的放线菌和霉菌。
影印平板培养法
母平板 另一选择 培养基
灭菌的 丝绒
印章
③夹层法
先出现
也称延迟补给 法。本法用于 细菌更为合适。
④限量补充培养法
6.营养缺陷型的鉴定
⑴鉴定方法
① 在一个平皿中加入一种营养物质以测定多株缺 陷型菌株(10-50株)对该生长因子的需求情况。 ② 在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对多种生长 因子的需求情况，称为生长谱法。
⑵营养缺陷型鉴定步骤
测定缺陷型菌株所需生长因子的类别
具体测定缺陷该类别物质中的哪种生长因子
用单一生长因子进行复证试验
缺陷型类别的测定
a.先选择缺陷型菌株所需用的类别代表物质。
①氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白陈，代表 氨基酸类。 ②酵母浸出液，其中氨基酸、维生素、嘌呤、 嘧啶均具有。
③维生素混合物，代表维生素类。 ④核酸碱基混合液或酵母核酸 (0.1 ％碱水解 物)，代表嘌呤、嘧啶类。
②产孢子的菌类
预培养
成熟而新鲜 的孢子