机械法和非机械法的比较
• 超声波破碎(15—25kHz)
机理 在超声作用下产生的空穴化作用 (cavitation)，空穴的形成和闭合产生极大 的冲击波和剪切力。
发声器和换能器 高频电流→ 机械振动 功率、工作时间（9S）、间歇时间、工作次数、 产热大、实验室
Ultrasonication 超声波
超声波破碎仪
超声破碎法
Gram-negative procaryotes
革兰氏阴性原核生物（E.coli）
• 革兰氏阴性细胞结构有三层：最外层约8mm厚，酶大多数
镶嵌在这层膜上。革兰氏阳性原核生物缺少最外层结构，
• 但有第二层肽聚糖层和胞浆空间。 • 第三层为浆膜层或内膜层，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性
都有这一结构，该层主要由磷脂组成，还有分散的蛋白 质分子和金属离子。
分类
机械法 固体剪切法(珠磨法) 液体剪切法 撞击法 超声法 渗透法
非机械法 酶溶法 化学降解法（酸碱法） 表面活性剂法 干燥法 冻融法
细胞膜
• 本节主要研究的是革兰氏阴性原核生物。 • 其细胞结构中没有细胞核：基因物质位于单链DNA上。
典型的生物是大肠杆菌，是生物技术研究的主体。 通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。
或0.2M溶质 。
• 例：一种耐盐细胞其能积累细胞内低分子
量卤化物，适应高渗透压，能在含有
0.32mol/LNaCl, 0.02mol/LMgCl2 , 0.015mol/LCaCl2, 0.01mol/LFeCl3 的培养基 中培养，当其从含盐量高的培养基中转移 至清水中，在数分钟内能将胞内产物释放 出来，试估计细胞膜所受渗透压的大小。 （设操作温度为25℃）
自溶作用：加热、干燥诱发
• 冻-融法
细胞 -15℃冷冻、室温融化 细胞膜疏水键破裂，胞内水结晶膨胀破裂
温和、破碎率低
• 干燥法
细胞膜渗透性改变，易抽提（丙酮、丁醇）
空气干燥（酵母）25-30℃热空气 真空干燥（细菌） 喷雾、冷冻干燥（不稳定生化物质）
非机械法
优点： A、产品释放的选择性； B、提取速度和收效高； C、产品的破坏小； D、对外界环境，如pH和温度等要求低。
珠磨法
• 高速珠磨机
珠直径、数量、悬浮液浓度、搅拌速度
Crushing in ball mill 珠磨法
WSK卧式高效全能珠磨机
ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机
高压匀浆器
影响因素
操作压力p：p, R 。温度 2C /10MPa 。 破碎次数N：N，R 。 温度：比速度k与温度有关，温度25C，k1.5倍。 细胞种类：如大肠杆菌比酵母易破碎
• 细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细
胞容易溶破，动物细胞只有当其组织被机 械切碎或匀浆后才易溶破。植物细胞很难 溶破，因为植物细胞中含有大量的木质成 分，通过渗透流很难渗透。
渗透流的动力来自渗透压，渗透压可以 过化学平衡来估算：
P=RTC 该式称为范特苛夫定律。
• 许多细胞内溶质浓度大约为0.1M NaCl
最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻
类更合适.
二、非机械法
化学法
方法
技术
原理
效果 成本
举例
化学法
渗透冲击 酶消化法 增溶法 脂溶法 碱处理法
渗透压破坏细胞 温和 便宜
细胞壁被消化，使 细胞破碎
表面活性剂溶解细 胞壁
有机溶剂溶解细胞 壁并使之失稳
解：细胞所受渗透压按照下式计算：
• P＝ RTC • ＝ 8.314×298×(0.32×2＋0.02×3＋
0.015×3＋0.01×4)×103
• ＝1.94×106 Pa
• 酶解法
阳性菌：溶菌酶，分解糖苷键，低渗溶液破裂 阴性菌：EDTA-溶菌酶、甘氨酸-溶菌酶、
青霉素法（抑制细胞壁合成）
酵母菌：蜗牛酶、纤维素酶 霉菌：几丁质酶、壳聚糖酶
动物细胞
植 物 细 胞 模 式 图
• 破壁难易程度
与壁强度、壁厚度、聚合物的种类、 细胞的形状和大小有关
细菌比真菌易破碎 G+用溶菌酶 G-添加EDTA，除去Ca2+
细胞破碎理论
1)、细胞破碎
A 压撞 B 剪切 C渗透 冻胀 膜
D 破壁破
2)、产物释放
一、机械法
方法
技术
原理
效果 成本
举例
机械法 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器劈碎 适中 适中
细胞破碎技术
※ Summary 概述 ※ Cell Membranes 细胞膜
※ Chemical Methods 机械破碎 ※ mechanical disruption 非机械破碎
概述
• 有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体
中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不 会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积，使胞 内产物释放出来一般需要破碎细胞壁 。
研磨法
细胞被研磨物磨碎 适中 便宜
动物组织及动 物细胞
超声波法 匀浆法（孔型） 珠磨破碎法
用超声波的空穴作 适中 用使细胞破碎
须使细胞通过的小 剧烈 孔，使细胞受到剪 切力而破碎
细胞被玻璃珠或铁 剧烈 珠捣碎
昂贵 适中 便宜
细胞悬浮液小 规模处理
细胞悬浮液大 规模处理
细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理
• 这三层有不同功能。外层及肽聚糖层使细
胞有一定的机械强度；破坏该层是本章讨 论的重点。浆膜层和细胞内膜控制细胞的 渗透压，即将营养物质运送到细胞内，将 代谢物排出胞外。
• 真核细胞，具有真正的细胞核，其结构要比
原核生物复杂的多，以图所示的酵母菌为例， 和原核细胞一样，真核细胞也具有一层细胞 膜。
超声破碎法
优点：适合于多种细胞的破碎
缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面 张力、液体体积和流速、探头材料和形状； B、有效能量的利用率低；C、产热大，需 控温； D、不易放大，仅应用于实验室规 模的细胞破碎。
JJ-2组织捣碎匀浆机
研钵
机械法
优点 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得
碱的皂化作用使细 胞壁融解
温和 温和 适中 剧烈
昂贵 适中 便宜 便宜
血红细胞的破 坏
胆盐作用于大 肠杆菌 甲苯破碎酵母 细胞
Osmotic Shock(渗透冲击法)
最简单的是渗透冲击法。 此法将一定体积的细胞液加到2倍体积的水 中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞， 使细胞膨胀，最后导致破裂，释放胞内物。