第5期
王维卓等: 重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白 !的发酵 pH 优化
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to g ain higher co ncent ration of H CL ! w hich reached t o 11 3 g /L , increased by 7 61% as com pared w it h const ant pH ferment at ion. Key words: H uman like col lag en !; recombinant escherichia coli; pH shif t cont ro l; o rganic acid
收稿日期: 2009 12 11 基金项目: 国家 863 计划基金资助项目( 2006A A 02Z246; 2007AA 03Z456) ; 国家自然 科学基金资助项目( 20776119) ; 陕西
省教育厅科学研究发展计划基 金资助项目( 07JK417) 作者简介: 王维卓, 男, 硕士研究生, 主要研究方向为发酵过程优化. * 通信作者: 范代娣, 女, 教授, 博士研究生导师. E mail: fandaidi@ nwu. edu. cn.
郭佳庆1, 2
摘 要: 为了实现类人胶原蛋白( H L C !) 的规模化生产, 对重组大肠杆菌 BL 21 3 7 在 30 L 发酵 罐中发酵生产类人胶原蛋白 !过程中的关键参数 pH 进行了系统的研究. 将发酵过程中 pH 控制 在 6 0~ 7 8 之间, 监测 pH 对细胞生长以及类人胶原蛋白 !的产量的影响, 从而确定出合理的 pH 控制策略增加类人胶原蛋白 !的产量. 由实验数据可得, 在 pH 7 5 条件下细胞浓度达到最大, 为 68 5 g/ L, 但 H CL !的浓度为 8 5 g/ L . 在 pH 6 8 条件下, H LC !浓度达到最大, 为 10 5 g / L , 但 其细胞浓度只有 60 9 g/ L. 同时, 对发酵过程中代谢副产物有机酸的含量也进行了监测, 随着发酵 过程 pH 值的升高, 总有机酸的量也相应的增加, 当发酵过程 pH 控制在 7 8 时, 总有机酸达到最 大, 为 15 61 g/ L . 为了提高目标产物的产量, 采用 pH 两阶段控制策略控制发酵, 最终类人胶原蛋 白 !浓度可达到 11 3 g/ L, 较恒 pH 条件下提高了 7 61% . 关键词: 类人胶原蛋白 !; 重组大肠杆菌; pH 两阶段控制; 有机酸 中图分类号: Q815 文献标志码: A
第 38 卷 第 5 期
陕西师范大学学报( 自然科学版)
2010 年 9 月 Journal of Shaanx i Norm al U niversit y ( Nat ur al Science Edit ion)
Vol. 38 N o. 5 Sep. 2010
文章编号: 1672 4291( 2010) 05 0072 05
因此, 我们较为系统地研究了 pH 值对重组大 肠杆菌发酵生产类人胶原蛋白过程中细胞的生长代 谢以及产物形成的影响, 以优化发酵工艺条件, 提高 生产效率.
1 实验材料及方法
1 1 菌种与培养基 基因工程菌 E. col i BL 21 3 7, 卡那抗性, 温度
诱导, 质粒 pN WCP31, 由本实验室构建并保存[ 11] .
M gSO 4 EDT A 微量元素 卡那霉素 消泡剂
87 42 55 25
1 06 0 005 01
26 12 6 16 5 20
3 3 0 005
1 2 发酵罐 瑞士 Bioengineering 公司 D1283 自动控制发酵
罐( 30L ) , 可在 线检测温度、搅拌速度、溶解氧浓度 ( DO) 、pH 值等过程参数. 1 3 培养方法 1 3 1 种子培养 从 L B 平板上刮取两个单菌落, 分别置于两个盛有 80 m L 种子培养基的 300 mL 摇 瓶中, 温度 34 ∃ , 转速 220 r /min 的条件下摇床培养 10~ 12 h, 获得一级种子. 然后转接至 8 个盛有 80 m L 种子培养基的 300 mL 摇瓶中, 相同条件下摇床 培养 10~ 12 h, 制备二级种子. 1 3 2 分批 补料培养 将培养好的种子接种至装 有 10 L 发 酵培养 基的 30 L 发酵 罐中, 控制 温度 34 ∃ . 在分批 补料培养阶段, 通过调节空气流量、提 高搅拌转速和罐压将细胞密度( DO) 控制在 20% ~ 30% 空气饱和度, 用 25% 氨水和 2 mol /L H 2SO4 自 动调节 pH . 当发酵罐中的葡萄糖耗尽时, 采用溶氧 反馈补料方式进行发酵. 当细胞密度( OD) 达到 90 ~ 100 时, 升 温 至 42 ∃ 开 始 诱导, 3 h 后 降温 至
种子培养基: 液体 L B 培养基. 分批发酵培养基 和补料培养基如表 1 所示.
表 1 培养基的组成 Tab. 1 Medium composition
成分
分批发酵培养基 / ( g # L- 1 )
补料培养基 / ( g# L- 1)
葡萄糖
40
酵母粉
50
1 000 40 0
Байду номын сангаас
K2 H PO 4 N aH 2 PO 4 ( N H4) 2 SO4
胶原蛋白又称胶原, 是动物体内含量最丰富的 结构蛋白. 胶原蛋白起 着支撑器官、保护机体 的作 用, 从而广泛应用于医药、材料、美容保健、食品、化 工等行业[ 1] . 然而, 来源于动物组织的胶原蛋白存在 疾病传染等问题, 限制了异种和异体胶原在人体中 的应用, 从而使得改性胶原备受关注[ 2] .
L B 培 养 基: 蛋白 胨 10 g /L; 酵 母粉 5 g /L; NaCl 10 g /L ; 琼脂 20 g /L .
卡那霉素( Kanam ycin, Kan) 抗性培养基: 蛋白 胨 10 g /L ; 酵 母粉 5 g /L; NaCl 10 g /L , Kan, 0 5 m g /m L.
重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白 !的发酵 pH 优化
王维卓1, 2 ,
范代娣1, 2, 3* , 骆艳娥1, 2, 3 , 马晓轩1, 2, 3 , 朱晨辉1, 2, 3 ,
( 1 西北大学 化工学院; 2 陕西省生物材料与发酵工程 技术研究中心; 3 陕西省可降解生物医用材料重 点实验室, 陕西 西安 710069)
Optimal Strategy of pH Control in the Production of HLC! by Recombinant Escherichia coli
WA N G Wei zhuo1, 2 , FA N Dai di1, 2, 3* , LU O Y an e1, 2, 3 , MA Xiao xuan1, 2, 3 , ZH U Chen hui1, 2, 3 , GU O Jia qing1, 2 ( 1 College of Chemical Engineering , N ort hw est Universit y; 2 Shaanx i R& D Center of Bio materials and F er mant at io n Eng eering; 3 Shaanx i Key Laborat ory of Deg radable Biomedical M aterials, Xi∀an 710069, Shaanx i, China) Abstract: T o achieve large scale pro duct ion of H L C !, t he key paramet er pH in pr oduct ion pro cess of human like collagen by recom binant Escher ichi a col i BL 21 3 7 w as syst em at icly invest igat ed in a 30 L f erm ent ation t ank w it h triplex t ur bine impeller. T he ef fect of pH rang ing fro m 6 0 to 7 8 on cell content and H LC ! production dur ing fermentat ion pr ocess w as st udied, and an opt imal pH strat egy w as det er mined f or increase of H LC ! yield. F rom experiment al dat a, t he cell g row t h and co llag en synt hesis w er e significant ly af fect ed by pH . A n o pt imal pH of 7 5 fo r cell g row t h w as obt ained w it h cell densit y at 68 5 g /L , t he concent ration of H L C ! w as 8 5 g /L; w hile an opt imal pH of 6 8 f or H L C ! accumulat io n w as obt ained w it h concentr at ion of H L C ! at 10 5 g /L, and cell densit y w as 60 9 g /L. A ddit ionally, t he t ot al org anic acid of fermentat ion process w as monit ored. T he concent rat ion of or ganic acid incr eased w it h pH , and the highest concent rat ion of o rganic acid, 15 61 g /L , w as observed w hen pH w as kept const ant at 7 8 during t he process o f f er ment at io n. Based o n t he r esult s, a pH shif t method w as developed