in vivo：体内蛋白质的硝基化是有选 择性的。蛋白印迹法发现，仅有几 种蛋白质可以在体内被硝基化。
三、酪氨酸硝基化对蛋白质功能的影响
主要有： 降低和抑制酶活性 打乱蛋白质中的有序排列 影响细胞内信号转导通路、抑制激酶信
号等。
四、硝基化酪氨酸去硝基化的可能性
COOH
H2N
CH CH 2
COOH H2N C H
nNOS (neuronal nitric oxide synthase)
(mostly in neuronal tissues)
eNOS (endothelial nitric oxide synthase)
(endothelial cells)
NO 合 成 机 制
两步机制
第一步：L-Arg氧化生成NOHArg、NOS血红 素结合体需接受2个电子以激活氧气；此 反应可能由[FeO]3+开始进行。通过L-Arg 胍基N-H的氢抽提反应而形成胍阴离子自 由基，然后胍阴离子自由基与[FeO] 2+结合， 形成NOHArg及血红素。
Tyrosine nitration
一、途径
ONOO-
H2O2+Cl-+NO2H2O2+peroxidase+ NO2H2O2+heme-proteinห้องสมุดไป่ตู้NO2H2O2+hemin + NO2H2O2＋N3-+Catalase
二、可发生硝基化的蛋白质
in vitro：几乎所有含酪氨酸的蛋白 质在硝化剂作用下都会被硝化。
第二步：NOHArg转变成NO，L-Cit。此 反应需1个电子从NOHArg中传递至血红素。
松弛平滑肌
NO
抑制血小板聚集及粘附，抗血
的
栓形成
生
杀死或抑制病原体
物
抑制肿瘤生长
功
神经信号传导
能
Nitroso-Fe/heme proteins
Nitroso-Fe/nonheme proteins
一氧化氮的生物化学
排泄的NO3－量大于吸收的量 （1916年） 发现LPS刺激能增大NO3－的合成(1985) 发现NO3－来自于精氨酸（1987）
NO激活小鼠脑和肝中sGC(1977)
历
提出内皮细胞舒张因子EDRF (1980)
史
提出EDRF即是NO的假说(1986)
检测到体内产生NO(1988)
R-tyr
HOONO
nitrotyrosine
Nitrotyrosine
Termination of lipid peroxidation
DNA oxidation DNA nitration Lipid strand breaks peroxidation
lipid nitration
Low MW compounds
Fe proteins
NO interaction with Zn finger proteins, p53
Zn proteins
O2
NO
Tyrosyl radicals
O2-.
NO NO2
ONOO-
DNA deamination DNA
N2O3
RSH “nitrosylatio n” nitrosothiol
Long-lived NO donors
Direct effect Low [NO]
Indirect effect High [NO]
环磷酸鸟苷途径
NO
sGC
GTP
cGMP
PK
非环磷酸鸟苷途径
作
用
Direct effect on proteins
机
制
NO 研 究 方 法
利用外源性含NO物质作为NO的来 源模拟NO对分子、细胞、组织器 官和机体的作用。
CH 2
?
NO 2
OH
OH
COOH
H2N C H CH 2
Heme RSH
NO 2 OH
COOH H2N C H
CH 2
NH2 OH
发现NO来自精氨酸(1988)
1998年诺贝尔生理和医学奖：
Robert Furchgott: 发现一氧化氮在心血管系统中的信使作用
Louis Ignarro: 发现一氧化氮在心血管系统中的信使作用
Ferid Murad: 发现一氧化氮在心血管系统中的信使作用
体内合成
NOH
NOS
NH2CNHCH2CH2CHCOOH
NH2CH2NHCH2CH2CHCOOH +NO
NH2
NH2
L-Arginine
L-Citrulline
L-精氨酸
胍氨酸
Nitric Oxide Synthase
NOS
iNOS (inducible nitric oxide synthase)
(found in macrophages, hepatocytes, vascular smooth muscle cells, fibroblasts and epithelial cells)
利用NO清除剂研究NO被清除时的 影响
利用NOS诱导剂或阻断剂来改变 NOS的活性以观察NO生成变化的 后果
利用免疫化学法检测NOS和NT
利用gene knockout技术
直接测定NO
外源性NO产生的办法
1) Cu + HNO3
Cu(NO3)2+H2O + NO
2) GSNO 由等摩尔的GSH、NaNO2和HCl混合反应而
成
3) Sodium nitropruside (SNP，硝普钠)
4) SIN-1
NO
对
S-nitrosylation
蛋
白
Tyrosine nitration
质
的
修
饰
S-nitrosylation
作用于蛋白质半胱氨酸残基
R-SH + NO
RSNO + H+
影响一些酶的活性 （NMDA受体，caspase-3, GAPDH等）