L-酪氨酸的酶法合成及分析
五、工艺路线
工艺路线一 • L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少 数氨基酸之一,收率低,环境污染严重, 应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸具有重 要的应用价值。用TPL合成L-酪氨酸,首先 开展的工艺是丙酮酸路线。 • Para等将包埋于聚丙烯酰胺凝胶中的 C.intermiedius固定化细胞作为催化剂, 分批添加底物,建立75mmol/L丙酮酸钠、 45mmol/L硫酸铵、45mmol/L氯化铵和 55mmol/L苯酚的转化体系,反应5h后可积 累L-酪氨酸10g/L。若将反应体系置于连续 的柱反应器内,苯酚对L-酪氨酸的转化率 达90%,且稳定性可维持5d。
试样制备: • 1. 高氯酸滴定液(0.1mol/L) • 配制:取无水冰醋酸(按含水量计算,每1g水加醋酐 5.22mL)750mL,加入高氯酸(70~72%)8.5mL,摇匀, 放冷,加无水冰醋酸适量使成1000mL,摇匀,放置24 小时。若所测供试品易乙酰化,则须用水分测定法测 定本液的含水量,再用水和醋酐调节至本液的含水量 为0.01%~0.2%。 • 标定:取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾 约0.16g,精密称定,加无水冰醋酸20mL使溶解,加 结晶紫指示液1滴,用本液缓缓滴定至蓝色,并将滴 定结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液 (0.1mol/L)相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。根 据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量,算出本 液的浓度。
进行电位滴定时,被测溶液中插入一个参比电极, 一个指示电极组成工作电池。随着滴定剂的加入, 由于发生化学反应,被测离子浓度不断变化,指 示电极的电位也相应地变化。在等当点附近发生 电位的突跃。因此测量工作电池电动势的变化, 可确定滴定终点。
试剂: 水(新沸放置至室温), 冰醋酸,无水 甲酸,高氯酸滴定液(0.1mol/L),基 准邻苯二甲酸氢钾,无水冰醋酸,结晶 紫指示液 仪器: 烧杯,玻棒,电子天平,棕色试剂瓶, 滴定管、滴定池、指示电极、参比电极
三、实验原理
• TPL由4个相同的亚基组成。Demidkina等将每个 亚基分成N-末端臂、小结构域、大结构域及结构 域间的连接区等四个部分。TPL的催化活性需要 磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate,PLP)作为辅 因子。每个亚基含有1个PLP结合位点,该位点位 于一个亚基大、小结构域与结晶学相关的另一亚 基大结构域之间形成的深裂内。TPL的催化活性 还需要单价阳离子K+或NH4+作为激活剂。每个亚 基含有1个K+结合位点,该位点位于结晶学相关 的二个亚基之间相联系的界面上,具有稳定催化 二聚体的作用。K+的配位数为7,它们是一个亚 基Gly52和Asn262的羧基氧、另一个结晶学相关 亚基Glu69的主链羧基氧与侧链羧基氧,以及三 分子水。Phillips等认为,Lys256紧邻PLP结合 位点Lys257,在单价阳离子结合位点的形成中具 有关键作用。不同阳离子与配位体在距离上的微 小差异,引起了活性部位构象的细微改变,这可 能是不同阳离子对TPL活性具有不同效应的原因。
【用途】 • 与糖类共热可产生氨基羰基间的反应,而产 生一种特殊的香料。必需氨基酸。 • 酪氨酸是酪氨酸酶单酚酶功能的催化底物, 是最终形成优黑素和褐黑素的主要原料。在 美白化妆品研发中,可以通过研究合成与酪 氨酸竞争的酪氨酸酶结构类似物也可有效地 抑制黑素的生成。 • 白癜风患者吃含有酪氨酸的食物可以促进黑 色素的形成,减轻白癜风症状。 • 医药用作甲状腺功能亢进;食品添加剂。 • 是一种重要的生化试剂,是合成多肽类激素、 抗生素、L-多巴等药物的主要原料。 • 广泛用于农业科学研究,也作饮料添加剂和 配制人工昆虫饲料。
L-酪氨酸的酶法合成及分析
L-酪氨酸的酶法合成及分析方案 的制定
--------夏小落
一、L-酪氨酸背景知识
• 英文名:L-Tyrosine 学名:2-氨基-3-对羟苯基 丙酸。一种含有酚羟基的芳香族极性α 氨基酸。是 组成蛋白质的20种氨基酸中的一种,是哺乳动物的 必需氨基酸,又是生酮和生糖氨基酸。符号:Y • CAS No.:60-18-4 • 产品描述:白色结晶体或结晶粉末,无味,易溶于 甲酸,难溶于水,不溶于乙醇和乙醚。在稀盐酸或 稀硝酸中溶解 • 生产标准:AJI92,USP26,EP4 • 分子式:C9H11NO3 • 相对分子量或原子量:181.20 • 密度:1.456 • 熔点(℃):l:342~344(分解);d:310~ 314(分解);dl:340(分解) • 比旋度:-11.3°至-12.1°
丙酮酸和L-丝氨酸对TPL均具有较高 的Km值,需在反应体系中过量加入, 不仅导致产率降低,而且引起产物分 离困难。
L-酪氨酸的分析
• 一、分析测定 • 酪氨酸—酪氨酸的测定—电位滴定法 • 本方法适用于酪氨酸的含量测定。 • 方法原理:供试品加无水甲酸溶解后, 再加冰醋酸适量,照电位滴定法(附录Ⅶ A),用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定, 并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL 高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于 18.12mg的C9H11NO3。
二、L-酪氨酸的酶法合成
• L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数 氨基酸之一,应用酶法取代水解法生产L-酪 氨酸是近年来氨基酸工业的研究热点之一。 • 酪氨酸酚裂解酶( tyrosine phenol-lyase, TPL,EC4.1.99.2) ,也称 β -酪氨酸酶, 在生物体内催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙 酮酸和氨,但在生物体外可将苯酚、丙酮酸 和氨转化为L-酪氨酸而L-酪氨酸常作为营养 增补剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸,以 及L-多巴、黑色素、对羟基肉桂酸、对羟基 苯乙烯等医药化工产品的制备原料。
• TPL催化L-酪氨酸裂解的最适pH为8.2, pH6.0时该酶基本没有活性。一般认为这种 高、低pH情况下的酶活差异是由于pKa约为 7.8的二种催化碱的质子化引起的。 • 酪氨酸酚裂解酶主要分布于肠细菌内,也存 在于一些嗜热菌和节肢动物体中,其中酶活 较高的微生物主要是草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、中间柠檬酸菌(Citrobacter intermedius)、弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)以及嗜热菌Symbiobacterium thermophilum和Symbi-obacterium toebii 等。近年来,来源于上述微生物的TPL,其 空间结构和作用机制已得到较深入研究,并 在工业化应用方面取得重要进展。
⒉ 结晶紫指示液
• 取结晶紫0.5g,加冰醋酸100mL使溶解。贮藏:置棕色 玻璃瓶中,密闭保存。 • 操作步骤:取该品约0.15g,精密称定,加无水甲酸 6mL溶解后,加冰醋酸50mL,照电位滴定法(附录Ⅶ A),用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定,并将滴定的 结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液(0.1mol/L) 相当于18.12mg的C9H11NO3。 • 注1:“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量 的千分之一,“精密量取”系指量取体积的准确度应符 合国家标准中对该体积移液管的精度要求。 • 注2:“水分测定”用烘干法,取供试品2~5g,平铺于 干燥至恒重的扁形称瓶中,厚度不超过5mm,疏松供试 品不超过10mm,精密称取,打开瓶盖在100~105℃干燥 5小时,将瓶盖盖好,移置干燥器中,冷却30分钟,精 密称定重量,再在上述温度干燥1小时,冷却,称重, 至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重 量,计算供试品中含水量(%)。
• 使用不同的指示电极,电位滴定法可以进行酸碱滴定,氧化 还原滴定,配合滴定和沉淀滴定。酸碱滴定时使用PH玻璃电 极为指示电极,在氧化还原滴定中,可以从铂电极作指示电 极。在配合滴定中,若用EDTA作滴定剂,可以用汞电极作指 示电极,在沉淀滴定中,若用硝酸银滴定卤素离子,可以用 银电极作指示电极。在滴定过程中,随着滴定剂的不断加入, 电极电位E不断发生变化,电极电位发生突跃时,说明滴定 到达终点。用微分曲线比普通滴定曲线更容易确定滴定终点。 • 如果使用自动电位滴定仪,在滴定过程中可以自动绘出滴 定曲线,自动找出滴定终点,自动给出体积,滴定快捷方便。
• 电位滴定法是在滴定过程中通过测量电位变化 以确定滴定终点的方法,和直接电位法相比, 电位滴定法不需要准确的测量电极电位值,因 此,温度、液体接界电位的影响并不重要,其 准确度优于直接电位法普通滴定法是依靠指示 剂颜色变化来指示滴定终点,如果待测溶液有 颜色或浑浊时,终点的指示就比较困难,或者 根本找不到合适的指示剂。电位滴定法是靠电 极电位的突跃来指示滴定终点。在滴定到达终 点前后,滴液中的待测离子浓度往往连续变化 n个数量级,引起电位的突跃,被测成分的含 量仍然通过消耗滴定剂的量来计算晶出来者,无色至白色丝 光针状结晶或结晶性粉末;d-体从水中 结晶者为无色晶体;dl-体从水中结晶者 为有光泽的针状晶体。为动物体内非必 需氨基酸! • 【制备或来源】 ⑴由含蛋白质的物质(废丝、酪蛋白和 玉米等)水解液中提取; ⑵以葡萄糖为原料,经短杆菌出发诱导的 l-酪氨酸生产菌发酵而得; ⑶以苯酚、丙酮酸、氨为原料,利用β 酪氨酸酶催化制取。
• TPL的作用机理 TPL催化的β -消除反应机制主要包括以下步 骤: 酶活性部位Lys257的ε -氨基与PLP共价 结合形成内醛亚胺,内醛亚胺与底物 L-酪氨 酸作用形成外醛亚胺,Lys257夺取外醛亚胺 (底物)Cα 质子产生醌型中间物,经底物Cγ 质子化及Cβ -Cγ 键断裂生成α -氨基丙烯酸 中间物,α -氨基丙烯酸中间物进一步受与 PLP结合的Lys257ε -氨基攻击再生TPL全酶
工艺路线三 • S-邻硝基苯-L-半胱氨酸(SOPC)是TPL适 宜的人工底物,其Vmax比生理底物L-酪 氨酸高三倍,而Km仅为L-酪氨酸的50%。 Phillips等以C.Freundii ATCC 29063 细胞悬液作为酶源,4mmol/LSOPC和 4mmol/L苯酚反应2h,苯酚的转化率就达 到70%,而且这一反应的最适pH较为宽泛 (6.8~9.0)。不过,SOPC价格较高, 从而限制了该工艺的工业化应用。