3、λ噬菌体载体的优缺点：•优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高。

•缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。

•用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因组文库。

第一章分子克隆的工具酶和载体•第八节噬菌体载体•一、λ噬菌体•（一）λ噬菌体•（二）λ噬菌体载体的改造•（三）λ噬菌体载体举例（三）λ噬菌体载体举例•Lambda gt10•Lambda gt11•EMBL3和EMBL4Lambda gt10概述：•Lambda gt10是一种插入载体。

•在噬菌体阻遏基因cI内有单一的EcoRⅠ克隆位点。

用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构建cDNA文库或基因文库。

•该载体克隆效率很高。

•在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。

•克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛选。

Lambda gt10map宿主：•建议用C600 and C600hf1作受体菌。

筛选：•如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬菌斑。

反之，若无插入，cI基因表达，噬菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。

•核酸探针杂交。

Insertional cloning•Insertional cloning into the cI gene of thelambda -gt10 cDNA cloning vector (DNA inserts of ~1-5 kb) can be selected in hfl (highfrequency of lysogeny ) mutant strains of E. coli. In hflA strains of E. coli, expression of the lambda cII gene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cI repressor gene which promotes lysogeny . Disruption of the lambda cI codingsequence by DNA insertion into the unique EcoRI site of the lambda gt10 cDNA cloningvector, blocks the lysogenic pathway leading to cell lysis and plaque formation.Lambda gt11•λgt 载体系列：是插入型载体。

插入了大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因片段，可以表达外源cDNA 而形成β-半乳糖苷酶融合蛋白。

•λgt18/19 、λgt20/21和λgt 22/23 是λgt 11的衍生载体。

•重组体筛选：•未重组的噬菌体载体转入lac -宿主后，在X-gal 平板上形成淡蓝色噬斑；而外源DNA 片段插入载体后，重组噬菌体形成无色噬斑，很容易辩别。

•常常用免疫学方法对噬班或菌落进行筛选。

Lambda gt10 mapLambda gt11 mapLambda gt11概述：•Lambda gt11是一个克隆和表达载体。

•用于小的插入（7.2 kb ）片断构建cDNA 文库或基因文库。

•在其β-半乳糖苷酶翻译终止位点上游的LacZ 基因内，有单一的EcoR Ⅰ位点。

•如果外源DNA 的阅读框与lacZ 吻合，即可表达融合蛋白。

•在构建cDNA 文库时，利用Oligo (dT)或随机引物合成的cDNA 经过EcoR ⅠAdaptors 或Linkers 修饰后，可以和λgt11连接起来。

宿主：•建议用Y1089(r-) and Y1090(r-)作受体菌。

筛选：•利用特异的抗体进行筛选。

EMBL3和EMBL4•EMBL3/4是由λ1059衍生的λ置换型载体。

•是常用的基因组克隆载体，克隆的DNA 片段大小为9-23kb 。

•多克隆位点分别位于一个14 kb 填充片段的两侧。

•两载体均在填充片段内含有red 及gam 基因，可由Spi 表现型筛选重组子。

•除多克隆位点的顺序相反外，EMBL3和EMBL4的其余特征相同。

red及gam基因•red及gam基因：编码一种与重组有关的（核酸外切酶和一种抑制E coli recBCD核酸酶活性）蛋白。

•二者抑制噬菌体使之无法在一些宿主菌（噬菌体P2的溶源菌株）中生长，•噬菌体P2的溶源菌株：如基因组内含有一个拷贝P2基因组的菌株。

•spi-筛选：当填充片段被外源片段取代时，重组菌株成为red-及gam-，噬菌体能在P2的溶源菌株中生长。

这一现象称为spi-筛选（对P2介入敏感）。

•spi-筛选不利于亲代载体，可降低非重组子的数目。

Replacement of lambda DNA •Replacement of lambda DNA containing the red and gam genes in the lambda EMBL3 genomic DNA cloning vector with BamHI compatible DNA inserts of ~10-20 kb, permits lytic growth of recombinant phage in E. coli strains containing the P2 bacteriophage lysogen.EMBL3和EMBL4•特征：1. 9-23kb的置换容量。

2. 未切的DNA，消化和去磷酸的DNA臂都是有效的。

3. 要提供宿主菌株。

•宿主：建议用NM538、NM539作受体菌。

LambdaGem-11•是EMBL3的衍生载体，有反向的T7及SP6两个启动子，可以合成RNA探针。

•在多克隆位点区域有特意设计的覆盖的XhoI及BamHI位点，它们分别离T7及SP6启动子为6及11个核苷酸。

•在T7及SP6两个启动子的两侧有非对称的SfiI位点。

•Bacterial strains KW251 and LE392 are included with LambdaGEM®-11 Arms.LE392, NM538 and NM539 are included with uncut vector DNA.提供（cDNA文库表达）载体的公司•Stratagene•Novagen•Invitrogen：Topo Gateway®•BD Biosciences ClontechLambda ZAP®II Vector•载体插入pSK质粒序列，能进行蓝白斑筛选。

•能产生单链环状DNA。

•用于序列测定或定点突变。

Charon4A、Charon21A、Charon32～35和Chaoon40载体•Charon载体：是为克隆DNA大片段而设计的置换型载体。

•Charon32～35和Charon40载体与以前构建的Charon4A和Charon21A载体相比较，可接受的DNA片段更大，可利用的限制酶切位点更多。

•Charon40：•外源DNA长9～24kb；•填充片段两侧各有一个方向相反的多克隆位点；•由许多头尾相接的小DNA片段构成的多填充片段、很容易除去，这是其得天独厚的优点。

因为用单一限制酶(NaeI)可将该片段酶消化成碎片，用聚乙二醇分级沉淀法轻而易举地除尽。

Charon4A•构建真核生物基因组文库的置换型载体。

•填充片段7kb。

载体选择的因素：•限制性内切酶的使用；•插入外源DNA片段的大小；•载体是否将被用于在E coli中表达所克隆的基因；•是否将以质粒或噬菌粒的形式从噬菌体中回收外源DNA；•携带的外源DNA是否将被装配成一个所克隆DNA的大的重叠的叠连群（overlapingcontig）。

（四）、文库的构建1、cDNA 文库的构建•Preparation of abacteriophage l cDNA library.2、基因文库的构建Construction of a genomic library of human DNA in a bacteriophage l vector .•Cloning in phage λ. Anonessential central region of the phage chromosome isdiscarded and the ends ligatedto random 15-kb fragments of donor DNA. A linear multimer (concatenate) forms, which is then stuffed into phage heads onemonomer at a time by using an in vitro packaging system.In vitro lambda phage packaging噬菌斑评价The plaque formation assay二、柯斯质粒载体（cosmid）背景•对于λ噬菌体基因组而言，只要含有cos 位点，即可与外壳蛋白包装成λ噬菌体颗粒；这样我们可以除去λ噬菌体中的左右臂和中段，仅留下两端包装所必需的cos序列，使其与适当长度的外源DNA序列重组，经包装、感染后，即可进行基因克隆。

Cosmid：•定义：即粘粒载体。

是即粘粒载体。

是一种人工构建的含有λ噬菌体的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。

•柯斯质粒能被包装到λ噬菌体颗粒中，通过感染大肠杆菌而获得扩增；它携带入宿主细菌的DNA片段（超过45kb）要比质粒载体携带的要大。

1、cos质粒构建•将左右臂和中段都去除，仅留下λDNA两端包装噬菌体所必需的cos 序列，再加上质粒的复制序列、标记基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。

•粘粒可插入30～45 kb长的外源DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。

•λ噬菌体最多只能携带23kb的外源DNA，所以粘粒主要用于DNA 文库的构建，以获得基因组大片段的DNA克隆。

cosmid构建•cosmid=cos site-carrying plas mid 由λ噬菌体的cos粘性末端+质粒人工构建而成。

•Cosmid：包括质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点、λ噬菌体的cos粘性末端。

Cosmid基因的克隆Cosmid的改良和选择：•1)将两个cos位点组合到同一个粘粒载体中，两个位点的存在将大大简化在载体中的定向克隆。