标本浓度
单细胞悬液
106/ml 正常全血
抗凝剂
取 100ul 100ul
EDTA3K （15%）约 10 微升抗凝 1 毫升全血 肝素 若抗凝不佳，有凝块，则不可检测
红细胞裂解
裂解液的选择： 保持细胞形态 红细胞裂解完全
反应温度
抗原抗体结合的最佳温度为 26~27ºC。避光。
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原理：
Hale Waihona Puke 免疫荧光分析细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合， 形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光 量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。
意义： 流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细胞表面和细胞内抗
原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，成为临床检验的一项 重要指标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗原位点的细 胞群区分开来，而且还能进一步区分各细胞亚群。对于造血系 统疾病、免疫功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评估都 起了重要作用。
第五课时
7，免疫荧光(三标记)，示范及练习(1~2hr)
第六课时 9，质控品、自动质控程序及质控数据库介绍：
FlowCheck，FlowSet，CytoTrol，ImmunoTrol， FlowCount，StemTrol
利用 FlowCheck 演示 QC 数据库 10，总结及试剂介绍
第七~第八课时 11，DNA 检测及分析： 检测原理 方案设计：阈值，PEAK 峰的概念，RATIO，设计一个 DNA 数据
能高效校正光谱重叠，从而获得更准确的结果。应用 ADC 技术，生物样品的测定可获得自 动的颜色补偿，并不受乳胶微珠的限制。只有 Beckman Coulter 流式细胞仪提供了享有专利 权的数字信号处理系统（DSP），故能达到最佳的线性效应、无漂移的放大作用和颜色补偿。
在单激光下进行 5-色分析变得无比容易 只有 FC 500 系列的流式细胞仪能在单激光或双激光条件下对多种不同的荧光色素进行
为研究性实验室设计了精密的、高效的操作程序 采用单激光或双激光激发方式，可进行 5 色分析 配备共线性（collinear）的第二根激光，对抗体和荧光色素的选择具有更大的灵活性 排除延时计算的需要和伴随的空间-分离光束的干扰
应用先进的数字补偿（Advanced Digital Compensation, ADC）可简化多色分析 Beckman Coulter ADC 技术是目前所能达到的最先进和最准确的颜色补偿技术。该技术
使操作人员能自动化操作仪器装置和获取数据，因而既使用方便又节省时间。
自动化调控装置 使日常操作程序标准化的装置以及 PMT 电压和补偿值的质量控制装置，为用户提供多 方便利 自动化地报告质量控制结果
简明的补偿设置及其调节 对执行多种应用的研究者来说是理想的选择 应用 FCS 3.0,20-位数据可进行在线和脱机两种列表方式的补偿 当样品正在采集中或已经采集结束后都可进行数据的处理
CytomicsTM FC 500 型流式细胞仪 培训教程
美国贝克曼库尔特公司（BeckmanCoulter Ltd.）流式产品部
CytomicsTM FC 500 系列流式细胞术系统
CytomicsTM FC 500 系列是一个装备了目前能获得的最先进技术的尖端产品家族。FC 500 系列具有灵活的检测功能，强大的软件和用户友好的操作界面，总之，能帮助研究人员 获得最佳化的工作流程和最高的工作效率。同时，每一台 FC 500 系统都能享受 Beckman Coulter 公司的仪器质量和售后服务的卓越信誉。
620nmBP
可以允许 610~630nm 的光通过
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信号放大方式： 经过 PMT 将光学信号转变为电脉冲信号，并增加 PMT 的电
压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种： 线性放大(Lin):
AMP
对数放大(Log)
AMP
通常散射光信号用线性放大，荧光信号用对数放大。但是注意 血小板的散射光用对数，而 DNA 的荧光信号用线性。
4. 检查 SYSTEM VACUUM 表，-17~-30 in.Hg 5. 检查 SYSTEM PRESURE 表，如果不在 28~32 PSI 之间，请完成
以下步骤 将 PRESURE ADJUSTER 钮拉出 调节压力至合适位置
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调节钮复位 预热约 10-15 分钟，仪器提示：Insert Sample Tube
全血标本制备
(免疫标记—直标法)
• 取 100ul 全血加入 12X75mm 试管中 • 加适量单抗(按抗体说明书所示) • 室温避光孵育 15-20min • 裂解红细胞
Q-Prep：直接将试管放入 Q-Prep 样本台上 Optilyse C：加 500ul Optilyse C，室温避光 10min
流式细胞仪组成
Cytometer Workstation Power Supply MCL
流式细胞仪主机 流式细胞仪工作站 电源箱 自动进样器
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流式细胞仪工作原理
光源： 液流： 细胞： 流动室： 检测器：
检测信号： 统计分析：
激光(488nm 氩离子空冷激光/633nm 氦氖空冷激光) 鞘液(Sheath Fluid) 单细胞悬液 Flow Cell 光电倍增管(PMT) 光电二极管 散射光(FS，SS)，荧光信号(FL1~FL5) 计算机
FC 500 用户培训大纲
预期目的：通过第一次培训后能够达到以下要求：
1，了解流式细胞仪的基本原理 2，了解 FC500 的基本结构、开机程序及常规保养 3，了解 RXP 的软件结构并能运用其进行数据采集和结果分析
等基本功能 4，掌握单标记及多标记免疫荧光标记的原理及基本要点，熟
悉基本的标本制备过程，能够进行方案设计，能够运用 Q_PREP。 5，了解 DNA 检测的原理及基本要点熟悉基本的标本制备过 程，能够进行方案设计，能够运用 DNA_PREP，并能运用 MultiCycle 进行细胞周期分析 6，了解并掌握流式质控的几个步骤以及相关质控品，初步了 解 QC 数据库的使用。
电压变化引起的信号强度变化(1hr)
第三课时 5，免疫荧光(单标记)：原理，方案，同型对照设定，Q_PREP
或 OptiLyse_C 使用，CytoTrol 及全血标本制备 (2~3hr)
第四课时 6，免疫荧光(双标记)：方案，同型对照设定，颜色补偿原理
及补偿设定，全血标本练习(2~3hr)
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加 500ul PBS，室温避光 10min 1500rpm 离心 5min，弃上清 1ml PBS 悬浮细胞，上机检测。
因 OptilyseC 中含有固定剂，故经该溶血素溶解的标本，可 在 84 小时之内测定，待测标本置 4ºC 冰箱保存。 Q-Prep 制备的标本亦可存放 48 小时。
其他溶血素： 氯化氨、草酸氨……
RD1(FL2)-干扰的 FITC(FL1)。即通常所说的：FL2-X%FL1
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颜色补偿判断标准： 未作颜色补偿
放大 放大
分析
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补偿后
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颜色补偿总结
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标本制备
单细胞悬液
外周血 骨髓 培养细胞 组织：机械法、酶法
荧光参数分析。 应用独特的数据简化显示的柱形图, 进行五维自动化表型分析，可以在单一位点上分析 出多达 32 种不同的表型 应用充分可见的发射光谱能拓展多色分析的范围，从而更提高仪器的灵活性水平
RXP 软件可进行自动的数据获取和应用设置 Beckman Coulter 高效 RXP 软件是 FC 500 系列的宝贵组件。它的 Windows 环境的平台
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A/D 转换：
不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程 直方图
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阈值(Discriminatior):
Required Signal
通常在进行免疫标记分析时，阈值设在 FS=100~150 DNA 分析时设在 FL3PEAK=30~50 峰值信号(PEAK)与积分信号(INTEGRAL)
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分光原理：
利用二向色性长通滤片(DL)及带通滤片(BP)可将不同荧光染料发 出的相应波长光谱区别开。
二向色性长通滤片(DICHROIC FILTER) 一定波长以上的光通过，该波长以下的光被折射。45 度角放置
光源
550nmDL
通过光
折射光
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>550nm 的光通过 <550nm 的光被折射 带通滤片(BAND PASS) 允许一定波长的光通过。
激光：488nm 氩离子空冷激光/633nm 氦氖空冷激光 注意环境温度及距离
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鞘液及流动室：
Injector
鞘液
侧向及荧光信号 前向散射光
光电倍增管：
检测信号：
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散射光信号：FS：细胞大小 SS：细胞颗粒性
荧光信号： FL1~FL5
下图示：仪器如何通过 FS 检测细胞大小及通过 SS 检测颗粒特性
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单标记免疫荧光分析
对数坐标 阴性对照----Isotype Control (去除非特异性结合)