• 2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium bromide (INT)
12
CTF
CTC的微生物细胞还原 无色非荧光分子 红色荧光分子
CTC CTF
Viable cell
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Example 2: Staining of Streptomyces sp. with CTC
24
25
Example 3: Comparison of confocal microscopy with fluorescent microscopy
Fluorescent microscopy
Confocal microscopy
显示的是一个光学切面
Fluorescent microscopy
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样品的3D-重建
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激光扫描共聚焦显微镜主要功能
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荧光染料作为底物由酯酶所水解产产生荧光分子
CFDA-SE
CFDA-SE
活性微生物细胞
活性微生物细胞将其还原为荧光分子并沉淀于
微生物细胞内
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4、膜电位（membrane potential）
工作原理：活性微生物细胞可维持细胞的膜电位， 可作为微生物细胞活性的一个评价的生理指标
1. 带正电荷荧光探针 Rhodamine 123 (Rh123); DiOC6(3) 进入活性细胞
2. 带负电荷荧光探针 Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine oxonol
DiBAC4(3) 进入死细胞
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5、pH荧光探针
工作原理：活性细胞可以维持胞内外一个合适的pH 梯度，因此，测定微生物细胞内的pH可作为细胞 生理状态的一个评价标准
1. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE)
链霉菌不同发酵时期：菌丝活性及内部结构
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2、代谢活性(metabolic activity)
微生物代谢活性分析的荧光探针主要有：
• 5-Cyano-2.3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC)
• 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2tetrazolium bromide (MTT)
激光扫描共聚焦显微镜在微 生物研究中的应用
1
2
激光扫描共聚焦显微成像
CTC 染色
Baclight Live/Dead 染色
Baclight Live/Dead 染色
3
主要内容
1、分子荧光的形成 2、微生物研究中常用的荧光染料 3、共聚焦显微镜基本原理 4、共聚焦显微镜在微生物研究中的应用
4
一、分子荧光的产生
2. Pranine
3. BCECF
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一些常见荧光染料的激发与发射波长
Probe
Physiological Excitation (nm) Emission
function
(nm)
PI
Membrane
535
617
integrity
CTC
Met0-660
DiBAC4(3) Membrane
9
1、膜通透性(membrane integrity)
BacLight Live/Dead (PI/SYTO9)
PI
SYTO9
PI
PI SYTO9
PI
PI
SYTO9 PI
SYTO9 PI
PI
PI PI
PI SYTO9
Viable cell
Damaged cell
10
Example 1. Staining of Streptomyces sp. with BacLight live/dead L7007
CTC 染色
CTC 染色
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3、酯酶活性(esterase activity)
工作原理：在活性微生物细胞酯酶作用下，将非荧 光分子水解，释放出荧光分子并依靠膜的完整性保 留于胞内
1. Fluorescein diacetate (FDA)
2. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE)
1.1 分子荧光产生的条件
1. 基态分子受到能量激发，吸收一定能量后，跃迁至 激发态, 通常为π→π*、n→π*跃迁
2. 激发态分子在很短时间内，以电磁辐射的形式释放 能量并返回基态，便产生了分子发光（荧光或磷光）
5
6
1.2 影响荧光的因素
1. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位
整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都 可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
20
3.2 共聚焦成像原理
21
22
3.3 激光扫描共聚焦显微镜与荧光显微镜比较 1. More Color Possibilities 2. Less Cross Talk（串色）
23
3. Optical Sectioning of Objects Without Physical Contact （光学切片） 4. Three-Dimensional Reconstruction of Specimen （三维重构） 5. Improved Resolution（更高的分辨率）
493
516
potential
Rh123
Membrane
507
529
potential
FDA
Esterase
492
517
CFDA-SE
activity
SYTO9
Membrane
488
permeant
509
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三、激光扫描共聚焦显微镜
3.1 激光扫描共聚焦显微镜的组成
显微镜光学系统 扫描装置 激光光源 检测系统
键的形成都将使化合物的荧光发生变化 2. 温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换 去活的几率增加 3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严 格控制
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二、微生物研究中常用的荧光探针
荧光探针主要基于测定微生物的某一生理进行分类
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微生物研究中主要的荧光探针：
1、膜通透性（membrane integrity） 2、代谢活性(metabolic activity) 3、膜电位(membrane potential) 4、酯酶活性(esterase activity) 5、pH 梯度(pH gradient) 6、其它