《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（4）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数48《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（5）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数48上海中医药大学《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（6）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数48实验6 组织总RNA提取实验目的1．了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的变化，如RT-PCR、Northern blot 等。

2．了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化，如DD-PCR、基因芯片等。

3．获得某一特定组织或细胞全部mRNA，以便建立cDNA库等。

4．获得某一特定组织或细胞全部RNA。

以上工作的前提是制备纯净且完整的RNA。

现代医学研究表明，人类的绝大多数疾病都是由若干基因表达的改变所引起的。

根据生物学“中心法则”原理，基因的表达包括转录与翻译两个阶段。

其中，由DNA到RNA的转录过程受到各种因素的调节，其调节水平反映出某种或某些特定的因素对相关基因表达的调节能力。

已有的研究一再表明，中医药所发挥的治疗与预防作用是直接或间接调整了基因的转录而实现的。

RNA主要由rRNA（占总量的80-85％），tRNA和核内小分子RNA（占总量的10-15％）以及mRNA（占总量的1-5％）所构成。

理论上认为每克组织（或108个培养细胞）可提取5-10mg RNA。

提取总RNA的方法有多种，比如：1）本实验介绍的方法，类似于本实验的Trizol方法（今天我们会介绍这样的方法），均称为一步法，方便而快捷。

缺点是RNA的获得量偏低，质量不够纯净。

2）超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。

缺点是实验时间比较长，要求离心过夜。

3）其它一些试剂盒，主要是利用某些特定的介质吸附RNA，驱除其它杂质，以后洗脱纯净的RNA。

可以在短时间内获得纯净的RNA。

但是价格比较昂贵。

原理本实验又称异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法。

方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白质变性。

离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相。

之后通过异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤等，便可得到较为完整与纯洁的总RNA。

实验准备（略）实验步骤（参照GIBCO BRC公司有Trizol试剂盒）1．引颈处死小鼠，剖腹切取肝脏组织50mg（或106-107个细胞），加入1ml Trizol液，剪碎，快速匀浆。

2．22℃，静置5min。

3．加入氯仿0.2ml，颠倒15s。

4．22℃，静置3min。

5．离心：4℃×15000转/分×15min。

6．取上清液0.5ml。

7．加入0.5ml异丙醇，混匀。

8．22℃，静置10min。

9．离心：4℃×15000转/分×10min。

10．弃上液。

11．加入1ml 4℃ 75%乙醇。

12．离心：4℃×10000转/分×5min。

13．弃上液，真空干燥5min。

14．用高压消毒过的去离子水25ul水冰上溶解，-70℃保存。

15．紫外分光光度计测定RNA的含量：取样本5ul加入石英比色杯内，加入蒸水0.8ml，充分混匀。

与蒸水对照。

读260nm、280nm两个测得值，记录。

计算：OD260为1时，为40ug RNA，所以计算如下：样本RNA含量（ug/ul）= OD260*160*40/1000当OD值260/280<1.8时，提示有蛋白或酚的污染。

实验结果得到比较纯净的肝组织总RNA。

据参考文献，分光光度计读数260/280 值为 1.85±0.04。

注意事项1．实验过程中要求创造一个无RNA酶污染的环境。

主要包括两个方面的工作，其一，极力避免来源于操作者的手及实验的器皿和试剂等外源性RNA酶的污染；其二，尽力抑制组织细胞中内源性RNA酶的活力，并尽可能地去除。

2．由于RNA酶到处存在，不易失活，极易造成污染而导致RNA的降解，造成实验失败。

因此建议所有用品均应严格按要求消毒，注明RNA专用。

严格按无菌操作要求操作。

通常用于RNA抽提与保存的塑料制品用DEPC水室温下浸泡过夜，再高压消毒。

注意，DEPC 处理的水和容器，必须高温灭活DEPC，以免其日后抑制其它酶的活性，导致实验失败。

玻璃制品泡酸反复冲洗后，250℃干烤3小时以上。

3．去除内源性RNA酶的方法可用酚/氯仿反复抽提几次，直至中间的蛋白层基本消失。

我们的经验是至少抽提3次以上。

4．实验过程中应将组织充分匀浆，一般可先将组织块用剪刀剪碎，以利于快速匀浆。

5．在酚/氯仿抽提过程中，一定要颠倒混匀充分，这样才能使蛋白质充分变性，才能充分去除蛋白质与RNA酶。

为了提高RNA的纯度，该步骤可以重复若干次。

6．抽提过程中，由于异硫氰酸胍是RNA酶的强抑制剂，在整个实验过程中不会产生RNA的降解。

但在加入75%乙醇洗涤时，以及RNA干燥和加水溶解时须防止RNA酶的污染。

7．在吸取上清时，切不可将上清与酚交界处的蛋白及下面的酚吸起，造成RNA的污染。

因此，通常轻轻吸取上清，且留有部分上清，以免搅起紧邻着的酚。

8．若需抽提大量RNA时，以上试剂、试管可按比例放大。

所获RNA建议分装，以免使用过程中反复冻融。

9．如果是培养细胞，先收集细胞，用PBS缓冲液反复漂洗3次，再加D溶液混匀细胞，后面的实验过程一致。

实验8Northern blot实验目的1．定量分析某一特定基因mRNA的转录与否，以及转录的水平。

2．比较两个或两个以上不同组织某一已知基因转录的差异。

3．比较两个或两个以上不同组织某一未知基因转录的差异。

由于此方法具有稳定、可靠、假阳性少等特点，多年来一直深受广大研究者的喜爱。

其结果可以同时反映某一特定基因RNA分子量的大小及其数量。

在中医药实验中通常以此来判别某一中医药方法对某一已知基因转录的调控作用。

例如我们的GnRH、N-ras、白蛋白研究。

通常观察某一分子的变化有两个层次，蛋白水平的和核酸水平的。

两者的含量变化均与其生成、代谢有关，而两者的作用发挥还关系到其质量、修饰、环境条件等因素，这些变化采用观察蛋白与核酸的量是不能回答的，所以对Northern blot的结果要有客观的分析。

类似目的的实验主要为RTPCR。

原理采用变性凝胶电泳，使RNA分子由小到大排列于凝胶之中。

应用虹吸原理，将RNA 转移至硝酸纤维素膜，烘干，使RNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。

与放射性标记的探针杂交，杂交后，洗去未被杂交上的探针和游离的同位素，将硝酸纤维素膜放射自显影，使胶片上出现对应于相应分子量mRNA的条带。

最后，对条带进行光密度扫描，并统计分析。

实验准备（略）实验步骤1．RNA电泳取10ug RNA旋转真空干燥，溶于20ul新配的样品缓冲液。

置样品于65℃水浴中5分钟，迅速移入冰中冷却，再加4ul上样缓冲液，混匀。

移胶至电泳槽内，注入电泳缓冲液1×MOPS，浸没凝胶，轻轻拔去疏子。

接通电源，负极靠近上样孔。

吸取样品24ul，注入上样孔内。

开启电源，电压调至100V。

电泳约2小时，至溴酚蓝移至前缘时，关闭电源。

轻轻取出凝胶，移至紫外透射反射分析仪上检查电泳结果。

在凝胶一侧放把尺，拍照。

2．RNA转移至硝酸纤维素膜取一洁净的容器，注入20×SSC，容器上缘架一水平玻璃板。

取2-4层滤纸，纸宽同凝胶长，纸长足以经玻璃板两侧浸入20×SSC中。

待滤纸全都湿透后，滚动移液管赶走滤纸间及其与玻璃板间的气泡。

切去凝胶上样孔及以上部分，在凝胶第一上样孔处切去一小角，作为记号，把凝胶底朝上放于滤纸上，用移液管赶走凝胶与滤纸间的气泡。

把硝酸纤维素膜裁成凝胶大小，对应凝胶剪去一小角，先浸湿于双蒸水中，再浸于20×SSC中，取出平放于凝胶之上，缺角处与凝胶缺角处对齐。

用移液管赶走凝胶与硝酸纤维素膜间的气泡。

膜上置2-4层20×SSC浸湿的滤纸，用移液管赶走滤纸与硝酸纤维素膜间的气泡。

用4张保鲜膜沿凝胶4侧盖住凝胶旁的滤纸、玻璃和容器，以防止凝胶外形成虹吸短路，以及容器内的缓冲液干燥。

在胶上滤纸之上方，铺4-6厘米厚的卫生纸，上置一平玻板，玻板上压一300-500克的重物。

过夜。

次日上午，取出凝胶与硝酸纤维素膜，在投射紫外灯仪上确认RNA已全部转移至硝酸纤维素膜上。

把该膜夹于两张洁净的滤纸间，在80℃真空干燥箱中真空干燥两小时。

3．探针标记（此工作与膜转移于同一天进行。

）水14 ulOLB 5 ulBSA （10mg/ml ） 1 ulDNA （30-50 ng ） 2 ul100℃×5min, 37℃×10min, 4℃×5minα[32P]dCTP （50uCi） 2.5 ul大肠杆菌聚合酶K片段0.5 ul混匀，4℃过夜，次日再加大肠杆菌聚合酶K片段0.5 ul半小时后加入终止液50 ul4．离心柱分离探针1）柱的制备取消毒过的蓝吸头，用小玻璃珠或玻璃纤维放入吸头，堵住出口，将混匀的Sephadex G50（中号）移入吸头至满。

取1.5ml Eppendorf管，剪去盖，放入10ml离心管中。

将蓝吸头插入Eppendorf管，可自制一套圈或用一垫圈套于蓝吸头前部，以保证吸头尖距1.5ml管底部约1-2厘米。

1600×g离心4分钟，弃去1.5ml管中的TE液，再用100ul TE液加入小柱，离心，如此反复两次平衡柱子。

2）分离用镊子取出原1.5ml管，取一新的1.5ml管放入10ml离心管，插上平衡过的小柱。

将标记的探针液，加入小柱，1600×g离心4分钟，小心取出1.5ml管，将分离的到的探针移入一标签过的1.5ml管，盖紧盖子。

5．探针变性将含探针的1.5ml管置于沸水中5分钟变性，迅速移入冰中冷却。

6．杂交将硝酸纤维素膜在2×SSC中浸湿，以防碎裂，然后放入杂交袋中，四周封口，剪去一角注入10毫升预杂交液，挤去气泡，封口，置此袋于40℃水浴摇床中摇晃预杂交1小时以上。

取出袋，拭干，剪去一角，将变性了的探针加入，挤去气泡，封口。

为防止含同位素的探针泄漏，外再封一杂交袋。

置此袋于40℃水浴摇床中摇晃杂交过夜。

7．洗膜取出袋，拭干，剪去一角，将杂交液注入50ml管中，存于4℃冰箱，以备再用。

剪去袋的四周，置此袋于2×SSC/0.1％SDS液中，取出膜，晃洗于此液。

移膜入新的2×SSC/0.1％SDS液中，于50℃中晃洗半小时，如此重复一次。

8．曝光取上膜封于杂交袋中。

在暗室中打开片盒，放X光胶片于增感屏上，再放上膜，盖上盒，将片盒存于-70℃冰箱中。

一天后冲片，视显影强弱，缩短或延长曝光时间。