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《生物工程进展》1997,V o l .17,N o .5单克隆抗体靶向制剂的研究进展徐风华3　蒋雪涛(第二军医大学药学院　上海　200433)摘要　本文综述了制备单克隆抗体免疫偶合物的三种方法,即抗体与药物直接交联的方法,药物通过小分子与抗体连接的戊二醛法、顺乌头酸酐法、活性酯法、N 2琥珀酰胺基232(22吡啶基二硫)丙酸法(SPD P 法)、腙衍生物法和肽键连接等方法,以及用大分子做载体的交联方法,并介绍了葡聚糖、聚谷氨酸、聚赖氨酸和聚合多肽作载体的性质和应用情况。

关键词　单克隆抗体　免疫偶合物 单克隆抗体(M onoclonal an tibody ,M A b )是药物理想的导向性载体。

自M athe 于1958年首次将抗鼠白血病免疫球蛋白与氨甲喋呤(M TX )交联用于导向治疗以来,相继出现了各种化疗药物与各种抗体的免疫偶合物,同时相应发展了许多交联方法。

蒽环类抗癌药物柔红霉素(daunom ycin ,DM )和阿霉素(A dri m ycin ,ADM )抗肿瘤活性强,分子中有多种活性基因(侧链羰基、氨基糖中的氨基、氨基糖氧化产生的醛基、侧链上活泼的Α2H ),是免疫导向化疗中研究得最多的药物之一。

本文以蒽环类药物为例,综述免疫偶合物的研究进展。

免疫偶合物发展至今,其制备方法可分为三类,即药物与抗体直接交联、药物通过小分子交联剂与抗体连接及药物通过大分子载体与抗体相连。

一、药物与单抗直接交联用EDC I 在药物氨基和蛋白质羧基之间形成酰氨键[1]。

由于酰氨键极为稳定,结合的药物不能释放出来,结果药物活性几乎全部丧失。

用N a I O 4氧化药物,在其氨基糖上产生羰基,与蛋白质氨基形成希夫碱,再用N aBH 4还原稳定[1—3]。

所得偶合物保留了一定的药物活性,体外对靶细胞显示出选择性毒性,但体内对延长荷瘤鼠的存活时间没有明显效果。

当偶合物的药 抗比较小时,较好地保留了抗体活性,但随着药物取代程度增加,抗体活性迅速下降。

142溴柔红霉素与单抗反应得到的偶合物(DM 2CH 2N H )2M A b 较好地保留了抗体的活性,体外对肿瘤细胞的杀伤作用较游离药物低,但明显显示了对肿瘤细胞的选择性毒性[4]。

二、药物通过小分子与单抗连接大部分药物2单抗偶合物都采用这种方法制备。

常用的小分子交联剂有戊二醛,顺乌头酸酐和N 2琥珀酰胺基232(22吡啶基二硫)丙酸[SPD P ]。

此外还有琥珀酸酐,马来酸酐,戊二酐,肼,寡肽等。

戊二醛和各种酸酐将药物分子中的氨基和蛋白质分子中的氨基连接起来,是同型双功能试剂;SPD P 连接的则是药物和单抗上的不同基团,称为异型双功能试剂。

11戊二醛法利用戊二醛在药物氨基和蛋白质氨基之间形成希夫碱,再用N aBH 4还原稳定。

所得偶合物较直接以希夫碱键相连接的偶合物药理活性强,但有不同程度的蛋白质分子间聚合,使抗体活性完全丧失[1]。

改进的戊二醛法[5]制备偶合物,很大程度地克服了上述缺点。

21顺乌头酸酐法621981年Shen和R yser[6]合作制备了柔红霉素2顺乌头酸2载体复合物,并证明免疫偶合物的作用机理是抗体与细胞表面抗原结合,内化入细胞并进入溶酶体,在溶酶体酸性条件下水解释放药物发挥杀细胞作用。

通常肿瘤部位pH值(平均614)较正常组织pH值(平均712)低[7],因此,在药物和抗体之间引入对酸敏感的键,使偶合物在体循环中保持稳定,到达靶部位后则释放游离药物发挥细胞毒作用,成为偶合物发展的一个方向。

顺乌头酸酐法制备的偶合物具有对中性条件稳定,在溶酶体酸性条件水解的性质,故在免疫偶合物的制备中得到广泛应用[4,7—8]。

31活性酯法药物氨基与酸酐,包括琥珀酸酐、枸缘酸酐、戊二酐、顺乌头酸酐[5—8]反应生成酰胺键,同时在药物分子上引入羧基,此羧基与N2羟基琥珀酰亚胺反应生成活性酯,再与单抗氨基进行亲核反应,所得偶合物比酸酐法得到的偶合物的药 抗比大,抗体活性保留好,但水溶液不稳定,易产生沉淀,药物活性下降较显著。

41SPD P法用SPD P将巯基引入蛋白质分子,再与药物衍生物反应制成单抗2药物偶合物。

优点是可以避免同种大分子的自身交联,因此在免疫偶合物及免疫毒素的制备中越来越受到重视。

51腙衍生物法腙键连接是继顺乌头酸酐法之后又一种制备酸敏感偶合物的方法。

SPD P先与肼(N H2N H2)、再与阿霉素作用生成阿霉素2腙衍生物(ADM2H zn);单抗与SPD P2D T T(二硫苏糖醇)反应,分子中引入巯基2SH,再与上述ADM2H zn反应制得偶合物[9]。

其作用途径同阿霉素2顺乌头酸2单克隆抗体(ADM2cis A co2 M A b)一样,因此它们体内抗肿瘤活性十分相似。

不同的是在保留抗体活性的前提下,ADM2 H zn2M A b的药 抗比大于ADM2cis A co2M A b,并且ADM2cis A co2M A b中30%ADM与M A b以非共价键结合,而ADM2H zn2M A b中游离药量少于总药量的5%。

61肽键连接由于偶合物最终到达细胞溶酶体,因此对溶酶体蛋白水解酶敏感的键可以构建有效的免疫偶合物。

M asquelier等[10]合成了多种柔红霉素(DM)的氨基酸和二肽衍生物,体外稳定性试验发现L eu2DM和A la2L eu2DM很容易被溶酶体酶水解释放DM。

之后,他们又制备了牛血清白蛋白与L eu2DM、A la2L eu2DM、L eu2 A la2L eu2DM及A la2L eu2A la2L eu2DM的偶合物,体外实验表明仅三肽连接的偶合物能被溶酶体酶溶解。

细胞毒试验结果:直接交联或以一个氨基酸相连的偶合物没有细胞毒性,以二肽相连的偶合物细胞毒性低于游离DM,而以三肽连接的偶合物细胞毒性远远大于游离药物,并提高了荷瘤鼠的长期存活率。

Kevin等[11]制备了类似的偶合物DM2 L eu2A la2M A b和DM2L eu2A la2L eu2A la2 M A b,结果A la2L eu2DM和A la2L eu2A la2L eu2 DM的细胞毒活性分别比游离药物下降100倍和250倍,它们与单抗的偶合物没有活性。

作者认为这种活性的丧失可能是由于单抗内化速度慢或抗原“隐蔽”导致抗体从细胞表面丢失造成的。

这方面的研究工作尚有待深入。

三、药物通过大分子载体与抗体相连以上论及的各种交联方法均属于直接交联法,它们共同的缺点是偶合物的药 抗比较小,以至在抗体允许的剂量下到达肿瘤部位的药物不能达到有效治疗浓度。

有些方法通过控制交联条件虽可得到较高的药 抗比,但偶合物的稳定性、尤其是抗体活性却迅速下降。

为了在保留抗体活性的前提下提高药物的交联量,人们在药物和抗体之间引入载体,即将较多的药物分子连结于聚合物大分子,再与单抗交联,这就是间接交联法。

间接交联法中主要载体有葡聚糖(D ex tran)、聚赖氨酸(po ly2L ysine)、聚谷氨酸(po ly2Glu tam ic A cid)、合成多肽、血清蛋白等。

它们与药物和抗体的交联方法不外乎上述已讨论过的各种方法,在此将不再赘述。

这里只论述一下各种大分子做载体的特点。

11葡聚糖(D ex tran)葡聚糖可用作代血浆,显然适于人体内应用,它是药物和酶的良好载体。

B ern stein等[12]试验了D exT210、D ex T240、D ex T2500(分子量分别为10kD,40kD和500kD),随着分子量增加,其载药量也增加:D ex T210的载药量为2—3m o l药物 m o l D ex,而D ex T2500的载药量为50m o l药 m o l D ex。

体内实验证明免疫偶合物中药 抗比为25时较为合适,D exT210作载体,药 抗比可达25:1,且易于分离,故常用D ex T210[2]。

但有实验表明分子量在40—70kD 之间的葡聚糖没有免疫原性[13]。

葡聚糖作载体最常用的方法是先将其氧化,再分别与药物氨基和抗体氨基反应生成希夫碱,最后用N aBH4还原稳定。

在氧化型葡聚糖与药物的混合液中,除其醛基与药物氨基形成希夫碱外,还发生以下反应[14]:与氨基及邻位羟基形成恶唑烷衍生物;与甲基酮生成醛缩合产生(缩醛);与芳香烃部分共价取代。

后两种产物不易水解,因此药物活性丧失。

恶唑烷衍生物不易还原,易水解,保留了药物的细胞毒活性作用。

希夫碱可水解,表现出细胞毒性,还原产生第二胺,结构稳定,避免了偶合物中药物在贮存及体内转运过程中解离,但细胞毒性下降。

B rich Z[15]考察了还原剂(氰硼氢化钠)对偶合物和药物的影响,证明还原使偶合物药理活性下降;非还原的A dr2PAD既保留了同游离药物相似的细胞毒性,同时对中性及弱碱性介质稳定,故认为制备偶合物时没有必要将希夫碱还原为仲胺。

葡聚糖作载体的另一种方法是用氯乙酸将其羧甲基化,再与水合肼反应,引入的酰肼基与柔红霉素侧链羰基形成腙键[14]。

该交联物体外细胞毒性及体内抗肿瘤活性均优于硼氢化钠或氰硼氢化钠还原的柔红霉素2氧化葡聚糖衍生物。

21聚谷氨酸(po lyglu tam ic acid,PGA)聚谷氨酸转运药物后,经体内蛋白水解酶水解生成无害的氨基酸。

此外,分子中的游离羧基使它具有聚阴离子特点,一些聚阴离子与化疗试剂表现出协同作用,并降低其毒性。

这是聚谷氨酸用作单抗2药物交联物中介载体的一大优点。

我们对六种规格的聚谷氨酸,即分子量分别为14,300、34,000、57,000的L2聚谷氨酸和分子量为14,000、31,400、70,200的D2聚谷氨酸进行了体外细胞毒实验,发现在作载体的浓度范围内,各种聚谷氨酸对细胞的生长都没有明显影响,并且它们之间没有显著差异。

应用聚谷氨酸制备免疫偶合物始于1975年[12]。

用腙衍生物法制备柔红霉素2L2聚谷氨酸2抗体偶合物(DM2PGA2Ig)[16],偶合物中药物通过酰胺键与L2聚谷氨酸连接,但偶合物的体内外抗肿瘤活性较游离DM、Ig、DM2PGA和DM2PGA2Ig均强,与药物直接经酰胺键连接于抗体导致失活是不同的。

已经证明柔红霉素氨基糖上的氨基与小分子化合物交联不会引起活性的较大损失[17],因此推测DM2PL GA2Ig 的作用机理是PGA在溶酶体内降解,生成柔红霉素的低分子量活性衍生物而发挥杀细胞作用。

31聚赖氨酸(Po lylysine)聚赖氨酸本身具有细胞毒作用,并且随着分子量和浓度的增加,细胞毒性迅速增强,其毒性作用机理已有过详尽的报道[18]。

由于D2聚赖氨酸不能被降解,所以通常用L2聚赖氨酸作药物载体,其优点是:(1)对某些癌细胞具有亲和性;(2)可以通过细胞内吞作用进入细胞;(3)在细胞内易于被胰酶样的蛋白酶降解。