pUC19
Multiple Cloning Sites pUC18
pUC系列质粒载体的优点
具有更小的分子量和更高的拷贝数
• pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp • pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变，导致rop基因
的缺失
适用于组织化学方法检测重组体
• LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基 因区段的β—半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种 互补现象叫做α—互补。
质粒DNA分子大小1-100Kb以上。
质粒DNA的复制
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 复制方向性：纯单向性（ColEI）；纯双向性（F质粒）；
既有单向又有双向性（R6K）。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分
为两大复制类型：
• 严紧型复制控制的质粒 1 – 数个 拷贝 stringent plasmid
去除两 个PstI
pBR313
EcoRII片 断去掉
pBR318 酶切
（6.3Kb)
体外重组 pBR322
pBR320 酶切
(4.3Kb)
(2.8Kb)
四、常用质粒载体类型
1、克隆质粒载体 2、表达质粒载体 3、多功能质粒载体 4、穿梭质粒载体
1、克隆质粒载体
克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁 殖的质粒载体。
pBR322插入失活效应
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Ampr
1)限制酶切 2)DNA重组
无DNA插入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有DNA插入 外源DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
无菌落
筛选重组子
阳性菌落
Ampr Tcs
提取DNA 电泳
重组DNA
利
BamHI片段(Tcr)
在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有 一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进 蛋白质翻译
在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终 止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳 定性
表达型载体（expression vector）
特点
• 基因的启动子序列和终止子序列 • 一般无检测标记基因 • 克隆位点是确定的（即位于启动子序列后） • 重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。
b
糖苷
X-
CHg2OaH l
HO
O
H OH H
O
H
H
H OH
Cl Br
N
lacZ’
a b-半乳糖苷酶的a-肽段
Cl O Br
N
N
Br Cl
Apr
利 用 菌 落
1)限制酶切 2)DNA重组
无DNA插入
Apr
转化
外源DNA 有DNA插入
Apr
颜
色
Ap r
Apr
筛选重组子
筛
白色菌落
选
重
组
提取DNA 电泳
1、在菌体内将R1drd19质粒（沙门氏菌中R1质 粒的一种变异体）的易位子Tn3（携带有Amp抗 性基因）易位到pMB1质粒上，构成一个较大的 质粒pMB3(13.3Kb)。
pMB3EcoRI* 大肠杆菌
AATT黏性末端环化 pMB8(2.6Kb)
导入
2、从质粒pSC101获得四环 素抗性基因（Tetr)。
建过程力求简单。
大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生 质粒克隆载体的构建
pBR322的构建是质粒载体构 建的一个典范。
pBR322的亲本质粒
• pSF2124，含有Amp抗性基因 • pMB1，含有松弛型ColE1的复制
起点（ori） • Psc101，含有Tet抗性基因
大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生 质粒克隆载体的构建
结构
• 转化单元--宿主细胞转化 • 表达单元--外源基因表达
表达型载体（expression vector）
类型
• Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+ 终止子 • Ⅱ型: 转录起始区终止子 + 翻译起始区（核糖体结合
序列和起始密码子）+ 终止子 • Ⅲ型: 转录起始区 + 翻译起始区 + 信号肽链编码区 +
控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合
Cop
Rep
Pco
co
p
p
P/Orep re
ori
p
质粒的不亲和性
有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下， 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细 胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中 必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质 粒称为不亲和质粒。
“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆 载体。
三、质粒克隆载体的构建
质粒克隆载体的设计和构建过程的原则
• 选择合适的出发质粒（亲本质粒）。 • 正确获得构建质粒克隆载体的元件。 • 组装合适的选择标记基因。 • 选用合适的启动子。 • 在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构
具有多克隆位点MCS区
• pUC质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点 • 具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHI)的外源DNA片段，
无需借助其它操作而直接克隆到pUC质粒载体上
pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理
pUC18/1 9
Plac MCS
5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳
子
重组DNA
Apr
2、表达质粒载体
是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质 的质粒载体
• 根据表达的蛋白是否分泌到细胞外：非分泌型表达载 体（胞内表达载体）和分泌型表达载体
• 根据表达所用的受体细胞：原核细胞表达载体和真核 细胞表达载体
表达载体与克隆载体的区别
强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因 有效的转录
3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同 要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表 达型载体及各种探针型载体。
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件
在克隆载体DNA分子合适的位置有一至 多个克隆位点，供外源DNA片段组入克 隆载体DNA分子。
Origin of Replication Hind II
第一节 质粒克隆载体
一、 质粒的一般生物学特性
发现：细菌，偶见于链霉 菌和酵母
独立于染色体之外进行复 制和遗传,又依赖于宿主 编码的酶和蛋白质来进行 复制和转录。•
比病毒还简单的亚细胞结 构，一旦离开寄主细胞则 无法繁殖。
一、质粒的一般生物学特性
在宿主细胞内具有较高的拷贝数。
• 一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件 下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。
CAP protein binding site -
591-554 (compl. strand); mRNA (LacZ) starts at nt position 507 (compl. strand); lac repressor binding site 507-487 (compl. strand).
以大肠杆菌的质粒为例：
• ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 • pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 • p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
质粒迁移
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
• 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个 细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等
质粒是细菌染色体外能够自主复制的 环形双链的DNA分子
在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共 价闭合环DNA分子（ccc-DNA）的 形式存在。
在体外理化因子作用下，质粒可以成 为开环DNA分子（oc-DNA）或线形 DNA分子（l-DNA）。
在变性条件下，质粒可成为单链DNA 分子（ss-DNA）。
载体的功能及特征
一、发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点 区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
终止子（常称之为表达分泌型载体）
ATG
I
II III
转录起始 翻译起始 信号肽
IV
成熟蛋白质
TAA
V
转录终止区
I II III
CS
I
V
CS
I
II
V
ATG CS
I
II III
V
CS--cloning site
• 松弛型复制控制的质粒 10 个 拷贝以上 stringent plasmid
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制
控制复制引物与模板的结合
RNA II 3’
5’
RNA I
ori
E.coli ColE1 plasmid
复制方向
5’
3’
rop
（+） Rop
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制
• pBR322质粒 • pUC系列的质粒载体