动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择3米力陈志南33(第四军医大学细胞工程中心国家863西安细胞工程基地西安710032摘要目前全世界蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过了现有生产能力。
动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台,以缩短产品工艺研发的时间,加快工业化进程。
当前被FDA 批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养,工艺设计是流加或灌流培养。
其大规模细胞培养生产所面临的挑战是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量;去除所有培养环境中外源因子的污染,更为精确有效的工艺控制手段,规模化培养中氧气的限定与溶解C O 2浓度累积的控制等。
关键词动物细胞大规模培养生产蛋白收稿日期:20032042103国家重大科技专项(2002AA2Z 344133通讯作者,电子信箱:chcerc2@动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一,并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。
专家预言:蛋白治疗药物如糖蛋白,抗体和多肽药物仅仅只是开始进入市场,预计在下一个10年或20年会有一个更为快速的发展。
蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过目前全世界的生产能力[1]。
由于动物细胞表达产品需求的紧迫性和生产工艺的复杂性,大大促进了该技术的深入研究与发展。
80年代初首先兴起了生物反应器研究,许多形式的生物反应器被用于哺乳动物细胞培养工艺的研究,如中置搅拌系统,固定单层培养和中空纤维系统等。
近10年的研究在解决动物细胞大规模培养的关键屏障技术,如限制性氧气的提供,消耗产物的积累,成熟精确的过程控制,剪切力的敏感性,和贴壁细胞培养规模化放大等问题都取得可喜的进展[2]。
目前动物细胞工业化生产中主要致力于提高单位细胞的生产力,确保产品质量和过程工艺设计的一致性,减少工业化生产中的污染与自动化控制等[3]。
以转基因动物和转基因植物为载体的重组蛋白生产在生物制药领域仍具有重要的地位,特别对于每年100kg 的超大规模需求量生产。
目前被美国FDA 批准的生物技术产品和已公开发表的生产工艺,都是较为成熟的工艺,并不代表当前动物细胞研究发展的趋势。
因此动物细胞大规模培养生产蛋白或抗体的工艺选择,应综合考虑产品特点、工艺难度与工艺研发时间,以加速其产品产业化的进程。
以下就目前动物细胞大规模培养成熟工艺与当前研究的问题、对策作一简述。
1目前美国FDA 批准的产品与生产工艺1996年1月至2002年12月美国获得成功批准的不同的治疗剂和诊断剂产品共31种,其中用哺乳动物细胞培养生产的就有21种(美国FDA 网页http :ΠΠw w w.fda.g ov 。
蛋白治疗药物有单克隆抗体治疗乳腺癌的Herceptin ,免疫球蛋白肿瘤坏死因子(T NF 受体融合蛋白治疗类风湿性关节炎的Enbrel 和灭活的甲肝疫苗Vaqta 等。
动物细胞培养技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技术,并逐步形成商业化操作水平。
按技术应用专利的分类,我们将这些产品分为重组治疗药物、疫苗、组织培养产品和诊断试剂并连同他们的生产形式列于表1。
总结表1的数据,在21种产品中有11种产品是用3种主要的细胞系CH O 、SP2Π0、NS O 生产的重组蛋白治疗药物。
首先重组治疗药物,主要是重组蛋白或抗体,对产品应用最有代表性的需要是生产第23卷第7期中国生物工程杂志CHI NA BI OTECH NO LOGY2003年7月表1 B LA哺乳动物细胞培养系统来源产品详细数据a(1996~2000 BLA产品名厂商批准日期产品形式细胞系方法培养液重组蛋白T enecteplaseΠT NK ase急性心肌梗死G enentech6Π2Π00重组糖蛋白CHO无报道无报道抗血友病因子G enetics Institute3Π6Π00重组糖蛋白CHO连续灌流无血清T rastuzumabΠHerceptin转移性乳腺癌G enentech9Π25Π98嵌合抗体CHO搅拌生物反应器,悬浮无血清InfliximabΠRem icadeCrohn’s diseaseC entocor8Π24Π98嵌合抗体NS0搅拌,悬浮灌流培养无血清PalivizumabΠSynagis预防呼吸道病毒M edImmune6Π19Π98嵌合抗体NS0搅拌,悬浮流加培养无血清BasiliximabΠS imulect 预防急性器官排斥N ovartisPharmaceuticals5Π12Π98嵌合抗体鼠骨髓瘤搅拌,悬浮灌流培养无血清DaclizumabΠZ enapax预防急性器官排斥H offman2LaR oche12Π10Π97嵌合抗体SP2Π0无报道无报道Rit uximabΠRituxan淋巴瘤IDEC PharmaceuticalΠG enentech11Π26Π97嵌合抗体CHO搅拌,悬浮培养含庆大酶素C oagulation factorⅨ重组凝集因子G enetics Institute2Π11Π97重组糖蛋白CHO搅拌,悬浮,反复批式培养无血清Interferon21aΠAv onex治疗复杂性硬化Biogen5Π17Π96重组糖蛋白CHO搅拌,悬浮培养无报道疫苗轮状病毒W yeth Laboratories8Π31Π98肝过滤病毒疫苗FRh L22N ot revealed 含胎牛血清狂犬病毒Chiron Behring10Π20Π97灭活狂犬病毒无报道无报道无报道甲肝疫苗M erck&C o3Π29Π96灭活病毒人二倍体纤维母细胞Adherent,NCF to C ostar Cubes连续流加培养含血清组织培养产品自体同源培养chondrocytesΠCarticel软骨缺陷修复G enzyme T issue Repair8Π22Π97自体同源细胞软骨细胞组织培养饼含血清诊断试剂产品人T淋巴细胞病毒用于酶联E LIS A Abbott Laboratories8Π15Π97抗体慢性感染人T、B淋巴细胞无报道无报道Capromab pendetide 肿瘤诊断Cytogen10Π28Π96鼠IgG1杂交瘤中空纤维反应器无血清含牛血清白蛋白,转铁蛋白N ofetum omabΠVerluma肿瘤诊断Dr K arl Thomae8Π20Π96鼠IgG2b Fab抗体杂交瘤无报道无血清Imciromab pentetate心肌诊断Centocor7Π3Π96鼠IgG2Fab抗体杂交瘤无报道血清,含庆大酶素a2000年至今又有7个动物细胞表达的重组蛋白和抗体药物被FDA BLA批准,但因多数无有关工艺的报道,此表未显示产量与质量,其生产形式至少70%是采用搅拌式生物反应器悬浮培养形式,50%以上采用无血清培养;疫苗和组织替代品其产品来源许多不用的细胞系,它需要特殊的生物反应器系统和培养液;虽然用于诊断的产品主要是单克隆抗体,类似于重组治疗,但需求量明显低,这就允许考虑多种特殊的生产形式和生物反应器系统。
因此,目前用哺乳动物细胞大规模培养生产蛋白的工业化过程,可以看作是以搅拌式生物反应器悬浮培养作为通用技术平台,使用常用的3种细胞(CH O、SP2Π0、NS O依托该平台工艺并使其生产能力提高。
平台工艺的特点是采用无血清培养和成熟的流加和灌流工艺。
2目前公开发表工艺的研究目前被批准的生物技术产品以及公开发表的工业化生产工艺,都建立在这个产品进入临床研究之前,因此这些技术不代表当前动物细胞研究发展的趋势,在工业化逐级放大生产过程中有些已体现出一定的滞后问题[3]。
2中国生物工程杂志第23卷当前哺乳动物细胞培养工艺中占有主流优势的是悬浮搅拌式培养工艺,特别是在重组治疗性蛋白和抗体的规模化生产。
在工业化生产中,悬浮培养工艺参数的放大原理和过程控制比其它培养系统较易理解和掌握,因此在规模化动物细胞培养生产中多选择悬浮细胞培养工艺(表1。
M oran等[4]和Schenerman等[5]悬浮流加培养CH O、NS O细胞,在Ⅰ2Ⅲ期临床研究单抗的生产放大中使用了202 452100L生物反应器,工业化生产放大到500220002 10000L,放大过程的工艺性能和产品特点都非常相似。
Sauer等用搅拌式生物反应器,无血清流加培养SP2Π0、NS O细胞生产人源化IgG抗体,工艺优化过程从3L215L2750L直接放大,其细胞密度,特异性抗体产生率和产品质量非常相似。
作者认为一个好的细胞培养平台系统可适用于许多不同重组蛋白或抗体的生产,选择适宜的平台系统可有意义地减少工艺过程所需的时间[6]。
悬浮贴壁细胞培养的传统方法是采用转瓶、堆积床和微载体悬浮培养,转瓶和堆积床培养的放大生产受到很大的限制,悬浮微载体培养是目前疫苗生产常采用的一种形式。
Wiktor等用悬浮微载体培养Vero细胞生产狂犬疫苗,初始工作种子在1L 生物反应器培养,然后是放大至5L225L2150L生物反应器,以后还可在放大到1000L或采用多个150L 的生物反应器,最后有效地感染病毒[7]。
非传统的贴壁细胞培养选用气升式生物反应器、膜透析生物反应器和填充床灌流培养等。
211悬浮细胞培养工艺悬浮培养适于许多细胞培养,如杂交瘤、鼠骨髓瘤(SP2Π0,NS O,对适于贴壁培养的细胞(CH O, BHK可进行细胞生长形式的驯化。
目前已发表的大量文献,就继续深入研究和进一步解释如何提高单位细胞的生产力;如何优化培养环境获得最高的产量,同时保持最好的产品质量;如何去除培养液中动物来源的成分,使大规模生产中的污染最小化;如何控制培养过程中的C O2的积累等进行了论述。
在大规模细胞培养中,细胞死亡是维持细胞高活性和高密度的最大障碍,由于在悬浮培养工艺中,细胞的死亡主要是因凋亡所致。
通过导入凋亡抑制基因(Bcl22来调节细胞抗凋亡的机制,延长细胞生存时间,促细胞活力和增加抗体的产量[8]。
悬浮培养工艺中影响细胞生产数量和质量的因素,主要应考虑细胞培养环境(营养条件、产物积累、pH、温度和渗透压,终产物(乳酸和氨毒性累积和必需营养物的添加等。
设计适应细胞生长的无血清培养基,控制营养物的添加,减少产物消耗积累是解决问题的有效手段。
1996年X ie等[9]运用化学计量法,根据动物细胞生长的需求,设计定量添加浓缩的培养液,将葡萄糖、谷氨酰氨的浓度维持在一个低水平,以改变细胞代谢方式。
在杂交瘤细胞流加培养周期超过550h,比较一般流加工艺特异性乳酸生成率减少了4倍,特异性氨生成率减少了10倍,细胞密度5×107Πml,峰值的活细胞密度大于115×107Πml,抗体累积浓度为214mgΠml[10]。