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• 三项改良 1、密码子偏倚
生物有时更加偏爱地使用一个或者一组密码子的现象。这 是在进化过程中基因复制的差异所产生的结果。如人类基 因中，亮氨酸大多被CUG编码，缬氨酸多由GUG编码。
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2、外显子-内含子边界
外显子/内含子边界符合的GT-AG规则
3、上游调控序列
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基因定位的实验技术
• 种属间印记
表型
基因型
• 同源重组可以灭活特定基因
目的基因的染色体 DNA与载体携带的破 坏基因重组，结果目 的基因失活。
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缺失框
缺失框包括抗性基因和其前面 在酵母中表达所需的启动子序 列以及两侧的限制性位点。 目的基因的首尾两侧插入限制 性位点中，将载体导入酵母细 胞中。 载体上的基因片段与染色体目 的基因之间重组，使后者失活。 发生基因破坏的细胞可以鉴定， 因为它们表达抗生素抗性基因， 可以在含抗生素的琼脂糖培养 基中生长。
大肠杆菌基因平均长度：317个密码子 酿酒酵母基因平均长度：483个密码子
人类基因平均长度：450个密码子 • 最简单的ORF扫描方式是将100个密码子作为假定
基因长度的下限，并记录所有大于此值的ORF。
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ORF扫描是细菌基因组基因定位的有效方法。此序列包含2个真基因—lacZ和 lacY，用直线表示。真基因比假ORF（波浪线）长得多。
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RNA干扰(RNA interference)用于目的基因失活
与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是 双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与 同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。
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基因过表达也可用来研究基因功能
也存在于果蝇homeless蛋白和人A-激酶锚定蛋白中，除含有
tudor结构域外，这些蛋白并不相似，但每种蛋白活性都与RNA
有关。
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同源性分析中酵母基因组计划中的应用
可疑的阅读框
已鉴定 的基因
单一孤 儿基因
通过同源性分 析鉴定的基因
孤儿家族未 确定的成员
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通过实验分析确定基因功能
• 通过基因失活进行功能分析
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确定单个基因的功能
利用计算机分析基因的功能 同源性搜索的基础是相关基因有相似的序列，因此可以通过与其他物 种中已知序列的相关基因进行序列相似性比较来发现新基因。 同源性反映了进化关系：同源基因有共同的进化祖先，基因之间序列 相似。 直源基因(orthologous gene)：不同种属生物间的同源基因 旁源基因(paralogous gene)：存在于同种生物中，常是多基因家族 的成员
ORF的识别是证明一个新的DNA 序列为特定的蛋白质编码基因的 部分或全部的先决条件。
双链DNA分子有6个阅读框，每条链都按
5’到3’的方向阅读，根据起始核苷酸不同，
每条链有3个可读框。
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• 成功寻找ORF的关键在于终止子在DNA序列中出现 的频率。
• 在随机DNA序列中，每个终止子出现的频率将平均 每43=64bp出现一次。随机排列的DNA不会有许多 长度超过50个密码子的ORF，而实际上，大多数基 因长度大于50个密码子。
相关生物的同源基因有相 似序列而非编码DNA通 常差异很大。如果一个物 种的DNA片段与相关物 种DNA有同源性，即表 明此段DNA含有一个基 因。
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滤纸 NC冲液
图 虹吸法转膜装置示意图
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准确定位外显子-内含子边界
外显子捕获
用于确定基因组DNA表达区域的 一项技术。将拟检测基因组序列 克隆在特异性表达载体所含两个 外显子之间的一个内含子中进行 表达。如果该基因组片段中包含 有一个外显子，表达产生的信使 核糖核酸(mRNA)长短会发生变化， 能够被检测出来。
解读基因组序列
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在基因组序列中定位基因
通过序列筛查定位基因
基因并非是核苷酸的随机排列，而是具有明显特征。这些特征决定了一段序列 是否是一个基因，而非编码DNA不具备这样的特征。 开放阅读框[open reading frame，0RF] 是结构基因的正常核苷酸序列，从起 始密码子（ATG）到终止密码子（TAA、TGA或TAG）的阅读框可编码完整的 多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子。
对载体的要求：1、松弛型载体；2、具有高活性启动子
通过基因过表达进行功能分析，目的是确定过表达的基因对转基因小 鼠表型是否有影响。因此将目的基因cDNA插入带有高活性启动子的载 体中，此启动子指导复制目的基因在小鼠肝细胞中表达。
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基因功能的深入研究
定点诱变可以用来探索基因的具体功能
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单一ORF扫描对高等真核生物DNA效果不佳 • 真核生物基因之间有较大的间隔区，假
ORF出现的可能性增大。 • 真核生物的基因存在内含子，在基因DNA
序列中没有连续的ORF。将阅读框和内含 子一起连续扫描往往会造成ORF提前终止。
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内含子使ORF扫描复杂化
图示含一个内含子的短基因的核苷酸序列，紧邻其下的氨基酸序列是正确 的翻译，其中内含子被去除，氨基酸序列被分为两部分。再下面一行是不 考虑内含子而得到的翻译序列，结果氨基酸序列在内含子中出现了终止。
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基因敲除小鼠
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非同源重组的基因失活
转座子标记(transposon tagging)：利用转座元件插入目的基因使其失活
使用重组DNA技术将一种可被半乳糖诱导的启动子序列装入酵母基因组 Tyl元件上游。当半乳糖缺乏时， Tyl元件不被转录而保持沉默。当细胞 被转移到含有半乳糖的培养基上，启动子被激活， Tyl元件被转录以起动 转座过程。
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同源分析可以提供整个基因或基因片段的功能信息
通常同源性搜索前先将核苷酸序列转换成氨基酸序列。
两个核苷酸序列有76%相同，用星号表示，可以作为序列同源的证据。然 而，当翻译成氨基酸序列时，只有28%相同，说明核苷酸水平的相似性是 偶然的。
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Tudor结构域
果蝇tudor蛋白的结构含有10个拷贝的tudor结构域。此结构域