特别是免疫活性。
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1.酶促反应的发光底物
• 是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。 • CLEIA中常用的酶HRP和AP • HRP的发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸 • AP的发光底物有AMPPD、4-MUP（荧光底物） • 特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物
1.1 鲁米诺
化学发光免疫技术
第一节 发光与化学发光剂
第二节 发光酶免疫测定（CLEIA）
（chemiluminescence enzyme immunoasssay）
第三节 化学发光免疫测定技术(CLIA)
（chemiluminescence immunoassay）
第四章 电化学发光免疫测定技术(ECLI)
(electrochemiluminescence immunoassay)
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H2O2 /OH —
HRP
+N2 + H2O +光
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对-羟基苯乙酸（HPA）
• HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚体（荧光 物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长 的荧光，可用荧光光度计测量。
1.2 HPA
H2O2 HRP
HO
CH2 COOH +荧
光
HO
CH2 COOH
HPO4 2—
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4-MUP
• 4-MUP被AP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的 激发光的作用下，发出448nm的荧光，可用荧 光光度计进行测量。
1.4 4-MUP
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AP H3PO4 +
4-MU
360nm
激发光
荧 光
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2.直接化学发光剂
特点：不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件 就能发光的物质。反应迅速、背景低、 信比高，发光量与AE浓度呈线性关系。
氧化二聚体
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AMPPD
• AMPPD在碱性条件下，被AP酶解生成相当稳定的 AMP-D阴离子，其有2～30min的分解半衰期，发 出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度 达到高峰，15～60min内光强度保持相对稳定。
1.3 AMPPD
OO
OCH3
AP /OH —
光
O-
化学2021发/3/2 光是一个多步骤的过程。
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萤火虫荧光素
荧光素酶 ATP；O2；Mg2+
光 + AMP+ O2 + CO2 + 氧化萤火虫荧光素
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化学发光 • 机制：某些化合物可以利用化学反应产生的能
量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子 激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基 态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。
2.化学发光免疫测定技术(CLIA)
chemiluminescence immunoassay
3.电化学发光免疫测定技术(ECLI)
electrochemiluminescence immunoassay
• 按分离方法不同分
1.微粒子化学发光免疫测定
2.磁2021颗/3/2 粒化学发光免疫测定
3
第一节 发光与化学发光剂
• 化学发光剂或发光底物：在化学发光反应中参
与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量
的化合物。
• 发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂
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化学发光剂应符合以下几个条件
①能参与化学发光反应； ②与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂； ③偶联后仍保留高的量子效应和反应动力； ④应不改变或极少改变被标记物的理化特性，
TPA+●
电极
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●
TPA
R u ( b p y )33 +
激发态
R u ( b p y )3 *
R u ( b p y )32 +
基态
不稳定
光 子 ( 6 2 0 n m ) 17 返回
技术要点
1.抗原抗体结合反应 将已包被了抗体的乳胶微 粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时间 后,再加入AP标记抗体，温育,形成固相包被抗 体-抗原-酶标抗体复合物
常用试剂：吖啶酯（acridinium，AE）
CH 3
N+
- HO 2
CO
O
R 2021/3/2
CH 3 N
O CO O
R
CH3 N
O CO O
+ CO2+ 光
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3.电化学发光剂
• 是指通过在电极表面进行电化学反应而发出 光的物质。
特点：①反应在电极进行； ②电子供体为：三丙胺（TPA） ③化学发光剂：三联毗啶钌
化学发光酶免疫测定技术反应原理图
E
E E
洗涤
E
弃上清
E
E
E
AMPPD发光
E
碱性磷酸酶
是利用酶对标 记发抗 光体 底物样 本催化作A M用P P而D 直接发光，
抗体包被
抗原
塑 料通2微021珠过/3/2 光强度的测定而直接进行定量。
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电化学发光原理图
• 这一过程可在电极表面周而复始地进行 • 产生许多光子，使光信号增强
一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时， 释放出的能量表现为光的发射。
1.光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。
2.生物发光:反应底物在荧光素酶的催化下利用 ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回 复到基态时多余的能量以光子形式放出。
3.化学发光:在常温下由化学反应产生的光的发射。
根据免疫学反应模式分
1.双抗体夹心法和双抗原夹心法
3.20固21/3/2相抗原竞争法：
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荧光酶免疫测定技术反应原理图
E
E E
洗涤
E
弃上清
E
E
E
4MU
E
激发荧光
碱性磷酸酶
是抗塑 体料利包微用被珠 理想标的记 酶抗 体荧光样抗底本原 物，生成的产物稳定并有 强的2021荧/3/2 光强度，通过测定荧光强度进行定量。15
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1
概念
• 化学发光免疫技术：集灵敏的化学 发光分析和特异的抗原抗体免疫测 定于一体的检测技术。
• 特点： 特异性高、敏感性高、分离简便、 快速、试剂无毒、安全稳定、 可自动化。
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化学发光免疫技术的类型
• 按发光剂不同分为
1.发光酶免疫测定（CLEIA）
chemiluminescence enzymeimmunoasssay
三联毗啶钌 分子结构图
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N
N
N
Ru
N
N
N
O O
N O
O
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第二节 发光酶免疫测定（CLEIA）
一、原理 属于酶免疫测定的一种。只是最后一
步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应
发出的光在特定的仪器上进行测定。
二、技术类型 根据酶促反应底物不同可分为： 1.荧光酶免疫测定技术 2.化学发光酶免疫测定技术