对于初级分析的项目，只需要给合作伙伴提供过滤后的数据即可，所以会对过滤后的数 据做dt1h LReenagdt2h
N3Z5123 FUNzPTEARAA 503060871000;536871 5725.71;52. 99.9971;99. 75 75
确定的？我们所说的插入片段长度是指 括了 read1 和 read2 本身的长度？
read1
和
read2
之间没有测到的那一段的长度还是包
1112..什解么释是Soilnedxeax测测序序中，几进个行关in键de的x技测术序：的边主合要成目边的测是序什（么S？BS），可逆阻断技术和桥式 。 PCR
2.信息分析流程：
软件（Conesa, A., S. Gotz, et al. (2005). "Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization 得到 的 and analysis in functional genomics research." Bioinformatics 21(18): 3674-6.) Unigene
Unigene
相似根性的据蛋KE白G，G从注而释得信到息该我U们n能ige进ne一的步蛋得白到功U能ni注ge释ne信的息P。athway 注释。
统计我，如们将下图Un所ig示en：e 和 COG 数据库进行比对，预测 Unigene 可能的功能并对其做功能分类
根据nr注释信息我们能得到GO功能注释。我们根据nr注释信息，使用 （ ） Blast2GO 2.3.5
本节问题： 1.Q20 是什么意思？ 2.BMS 系统上给出的 Q20%值是如何计算出来的？ 3.转录组暂时执行数据质量标准是怎样的？你有什么更好的建议（拿出自己的测试数据）？ 4.在统计数据信息时，read1 和 read2 长度相等吗？ 5.read每个碱基测序错误率的分布如何？read测序长度增加有什么好处？为什么SOAP比对 的时候允许 3’端有更多的错配？ 6.如何根据 BMS 上的碱基频率分布图查找建库或测序失败的问题？
G得O到注每释个信U息nig。enBela的st2GGOO注已释被后其，我它们文用献引W用EG超O过软1件50(
次，是同行广泛认可的 Ye, J., L. Fang, et al.
G(2O00注6)释. 软"W件EG。O:
a web tool for plotting GO annotations." Nucleic Acids Res 34(Web Server issue):
2.3 功能注释
原理： 首 先 ， 通 过 （ ） 将 blastx blast-2.2.18 Unigene 序 列 比 对 到 蛋 白 数 据 库
Swiss-Prot(ftp:///pub/databases/uniprot_datafiles_by_format/fasta/),
11..3 本 在建节库问过题程：中，我们是先对RNA进行片段化后合成cDNA还是先用RNA合成cDNA再对cDNA
进行片段化？为什么要这样做？
2. 3.
相名对词于解生释：物芯插片入，片华段大的测序有什么优势?
4. 5.
f名as词tq解文释件：中Praeiar-desn的d r格ea式ds是怎样的？
W293-7.)对所有 Unigene 做 GO 功能分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。
如下图所示：
本节问题： 1.用 blast 比对时，blast 格式的选择和 evalue 阈值的设定是怎样的？ 2．为什么我们会去掉较短的组装序列，选用大于 200 的序列比对？ 3．如何降低比对所用时间？ 4．在 COG 图中，请问每个分类的参考数据库是什么？ 5．介绍一下我们比对用的四大数据库。 67．．Gbleanste和Onbtolalto这gy（两简个称比对GO软）件的有含何义区？别，各自的特点是什么？ 98..流从程Nr中库对的b注las释t 比结对果得中到得的到mG0O格分式类的结结果果是是怎如样何一处个理过得程到，最用终到表了格哪格些式软的件结工果具文？件的？ 10.何做选bl择astb比las对t 的的建第库一类步型工？作是工作是什么？blast能够实现哪几种可能的序列比对方式？如
3. A该da参pt数er属c于on建ta库mi问na题ti，ona%dap(t记er为污Ad染a影pte响r实%)际产量。 4. Q20% (高于 80%)
该参数反映总体质量情况，de novo 项目 Q20 都应高于 80%，如果低于 70%则会严重影 响组装。质量非常差的数据，加进去会使组装效果变得更差。 5．GC%:
转录组 De novo 流程工作手册 1．De novo 流程生物学原理
1.1 实验流程
提取样品总 RNA 后，用带有 Oligo(dT)的磁珠富集真核生物 mRNA（若为原核生 物，则用试剂盒去除 rRNA 后进入下一步）。加入 fragmentaion buffer 将 打断 mRNA 成链短，片然段后，加以入缓mR冲N液A、为d模N板TP，s、用R六N碱as基e H随机和引D物N（A rpaonldyommerhaesexaIm合er成s）第合二成条第一cD条NAcD链N，A 在接经测过序接Qi头aQ，ui然ck后P用CR琼试脂剂糖盒凝纯胶化电并泳加进行EB片缓段冲大液小洗选脱择之，后最做后末进端行修P复C、测序。 11..2R测aw序c质 lus控ters (16 万~18 万) 对于 De novo 测序，质量胜过产量，小片段(200-500bp)宜上 18 万尽量缩小波动范围， 如果超过 20 万或者低于 15 万，则会影响质量和产量(Q20%，GC%),cluster 密度越高，数据 产量越大，但相邻 cluster 之间的荧光信号易相互干扰，影响数据质量；反之，cluster 密 度越低，相邻 cluster 的荧光信号越容易识别，但数据产量也较低。 2. Basecall duplicate% 该参数属于 solexa-pipeline 自身问题，只影响实际产量。
Gene Indices clustering tools (TGICL): a software system for fast clustering of large EST
冗dat余aseUtns.i"gBeinoei。nf最orm后a，tic将s 1U9n(i5g):e6n5e1序-2列.）与做蛋进白一数步据序库列n拼r、接S和wi去ss冗-P余ro处t、理KE，GG得和到尽COG可做能b长la的s非tx
2原.1理数：据过滤： 测序得到的 reads，并不都是有效的，里面含有带接头的，重复的，测序质量很低的 ， reads
数这据些处re理ads的会步影骤响：组装和后续分析，我们必须对下机的 reads 过滤，得到有效 reads. 1 去除含 adaptor 的 reads 2 去除 N 的比例大于 10%的 reads 3 去除低质量 reads（质量值 Q <= 5 的碱基数占整个 read 的 50％以上） 4 获得 Clean reads，后续分析都基于 Clean reads
由于 De novo 项目的 GC%在最开始一般不知道，所以要采取更加灵活的处理方式，而不 是值设和定标死准板差，的以标及准，每如个误l差an在e 的+-%GC为%离合差格，,现来在反一映般总是体3变5-化65情%。况可。以如通果过r计aw算c所lu有stelran浓e 平度上均 的过高或者试剂出现问题，会导致 GC%在 reads 尾部分叉，严重时需要截去 reads 尾部一段 长度的序列。 6．Insert size:
比间对的（比对ev结al果ue<有0矛.0盾00，01则），按取n比r、对S结wi果ss最-P好ro的t、蛋K白EG确G 定和 UCnOGig的en优e 先的级序确列定方向Un。ig如en果e 的不同序库列之方 向，跟以上四个库皆比不上的 Unigene 我们用软件 ESTScan（Iseli, Jongeneel et al. 1999） 预测其编码区并确定序列的方向。对于能确定序列方向的 Unigene 我们给出其从 5'到 3'方 向的序列，对于无法确定序列方向的 Unigene 我们给出组装软件得到的序列。 本节问题： 1.Kerm 的含义？ 2.contig 的含义？ 3．scaffold 的含义？ 4．unigene 的含义？ 5．N50 的计算？ 6．聚类的标准是什么？ 7．有两个 read，read1：ACCAGCA；read2：TCCAGCA 请按照 kerm=5,构建 De bruijn 图 8．用不同 K-mer 组装得到的结果有什么差异？能合并吗？ 9.影响组装的因素一般有哪些？ 10，评价转录组的组装效果的常用指标有哪些？ 11.转录组组装与基因组组装相比有何特点，制约转录组组装的主要因素有哪些？ 1123..为插什入么片补段洞长后度的的大sca小ffo对ld组还装要结做果一有次何聚影类响，？主要目的是什么？
2.2 组装：
原理： 使用短 reads 组装软件 SOAPdenovo（Li, R., H. Zhu, et al. (2009). "De novo assembly of
装hum。aSnOgAePndoemnoevsow首ith先m将as具siv有el一y p定ar长all度el sohvoertrlreaapd的seqrueeandcsing连."成G更en长om的e 片Re段s.），做这转些录通组过从r头ea组ds overlap 关系得到的不含 N 的组装片段我们称之称为 Contig。然后，我们将 reads 比对回 Contig，通过 paired-end reads 能确定来自同一转录本的不同 Contig 以及这些 Contig 之 间的距离，SOAPdenovo 将这些 Contig 连在一起，中间未知序列用 N 表示，这样就得到 Scaffold。进一步利用 paired-end reads 对 Scaffold 做补洞处理，最后得到含 N 最少，两 端不能再延长的序列，我们称之为 Unigene。如果同一物种做了多个样品测序，则不同样品 组装得到的 Unigene 可通过序列聚类软件 TGICL（Pertea, G., X. Huang, et al. (2003). "TIGR